miRNA——一种新的分子系统学研究标记

张际峰，崔家昌

（淮南师范学院生物工程学院，安徽 淮南 232038）

化学研究

miRNA
——一种新的分子系统学研究标记

张际峰，崔家昌

（淮南师范学院生物工程学院，安徽 淮南 232038）

microRNAs(miRNA)是真核生物中长度约为21~25个核苷酸的非编码小分子，作为动植物转录后基因表达的重要调控因子是近年来分子生物学研究的前沿和热点之一，然而利用miRNA作为分子标记进行分子系统学研究的报道甚为少见。利用miRBase数据库，本研究收集并拼接了多数物种均共同存在的miRNA碱基序列，利用Clustal X 2.0和MEGA 5.0软件尝试构建了它们的分子系统树。分子系统树获得结果与传统的系统分类学相一致。为从基因调控的角度探究生物的分子进化提供了新的研究思路。

miRNA；分子系统学；进化分析

miRNA全称是microRNA，是一段长度为20到25个核苷酸的小RNA分子①徐源，孙铁成，张爱玲等：《卵巢miRNA研究进展》，《畜牧兽医学报》2014年第4期，第509-516页。。它最早是Lee在秀丽隐杆线虫中发现的②Aung K,Lin SI,Wu CC,et al."pho2,a phosphate overaccumulator,is caused by a nonsense mutation in a microRNA399 target gene",Plant Physiology,Vol.141,2006,pp.1000-1011.，miRNAs与RNA诱导沉默复合体（RISC）③Brinkley BR."Managing the centrosome numbers game:from chaos to stability in cancer cell division", Trends in Cell Biology,Vol.11,2001,pp.18-21.一起互补性地结合于靶基因转录体的序列，从而降低或是抑制靶基因的转录和翻译。细胞中的miRNA具有多种重要的调节功能，据报道，人类有1/3的基因可能都受到miRNA的调控。它们与靶基因的调节关系往往是多对多的。近年来，miRNA的研究广受关注，特别是发表与miRNA相关的论文数量增长很快。根据miRBase的数据库(www.mirbase.org)记录显示：目前一共发现miRNA前体序列约28000条，成熟序列总共30000多条，这为研究miRNA的进化提供了大量的资源。

在高等动物的miRNA的研究中发现，miRNA位置在不同的物种中是高度保守的，且miRNA在序列上也呈现出高度的同源性。miRNA高度的保守性与其功能的重要性，及其靶基因均有着密切的关系。这些特征为miRNA作为重要的分子标记研究生物进化提供了基础。然而，基于miRNA探究所在物种的分子进化的研究鲜有报道。

本文尝试利用miRNA序列研究物种的分子进化。基于miRBase数据库，本研究收集并拼接了多物种的多条miRNA序列，利用Clustal X 2.0和MEGA 5.0生物软件，构建分子系统树。为从基因调控的角度探究生物的分子进化提供了一个新的尝试和研究思路。

1材料与方法

1.1获取10个物种的miRNA-7的成熟碱基序列

从miRNA专门的公共数据库miRBase（http:// www.mirbase.org）中下载埃及伊蚊冈，比亚按蚊，果蝇，烟草天蛾，佛罗里达文昌鱼，家犬，猕猴，海七鳃鳗，小家鼠，黑猩猩共10个物种的miRNA-7（简写为miR-7）基因家族的成熟碱基序列。序列信息如表1所示。

表1 miRNA-7基因家族10种生物成熟序列比对

1.2获取5个种不同物种的6条miRNA的成熟碱基序列

为了保证所选miRNA存在于共同的物种中，本研究进一步从miRBase数据库中分别下载并获取了佛罗里达文昌鱼，海七鳃鳗，小家鼠，黑猩猩，意蜂共5种物种的miRNA-7、miRNA-9、miRNA-10a、miRNA-31、miRNA-34、miRNA-91共6条成熟的碱基序列。并把这6条成熟的miRNA的碱基序列按照上述排列顺序，首尾相连拼接起来。序列信息如表2所示。

1.3分析系统发生

利用Clustal X 2.0软件对所有已经搜索下载获得物种的miRNA的成熟碱基序列进行多序列比对分析。然后利用MEGA 5.0软件中的NJ法，以意蜂为外群，建立4个物种的分子系统树（系统树重复1000次获得其自检值），对缺失信息采用完全删除的方式。

表2 5种不同物种的6条miRNA成熟的碱基序列

2结果与分析

2.1成熟的miR-7序列分析与建树

为了探究miRNA序列的保守性情况，首选从公共数据库miRBase获取多数物种均存在的miR-7的成熟的碱基序列，比对分析后发现：除果蝇外，其余9个物种的miR-7的成熟碱基序列相似度为高于98%，由此说明miR-7基因在不同物种间高度保守。在它们的碱基序列中，U的含量平均最高,为44%，而C的平均含量最低，仅为4%。

图1本研究涉及物种的miR-7成熟序列的碱基组成情况

随后利用Clustal X 2.0.软件对这10个物种的miR-7小分子RNA碱基序列进行比对，利用MEGA 5.0软件的NJ法构建系统进化树。获得系统树如下图2所示。

图2 MEGA5.0软件运用NJ法构建miR-7序列一致性分子进化树

图2的进化树显示，高等哺乳类、低等的无脊椎动物没有聚在一起，而是被随机地分开，且聚类后类群没有可信的支持水平（<75%，图中未显示）。因此利用单一的miRNA无法推演出生物间的进化关系。究其原因有两点：（1）miR-7在这10种物种间保守性很高；物种间进化的差异性没有体现出来；（2）序列很短，仅有23bp的长度，短的碱基序列很难涵盖更多的进化信息。因此，要利用miRNA构建物种的进化树，必须收集更多的miRNA序列信息才行。

2.2利用6条miRNA序列构建分子进化树

为了避免上述研究的缺陷，本研究再次从miRBase数据库中获取更多的miRNA序列信息。通过过滤出多物种中均存在的miRNA-7、miRNA-9、miRNA-10、miRNA-31、miRNA-34、miRNA-91共6条序列，这些物种为佛罗里达文昌鱼，海七鳃鳗，小家鼠，黑猩猩，意蜂，其相关信息详见表2。随后将同一物种这6条miRNA成熟的碱基序列首尾相连，拼接起来形成一条长度约140bp的新的序列。利用Clustal X 2.0.软件对比这5条序列，再利用MEGA 5.0软件中的NJ法，以意蜂为外群，构建这4个物种的分子系统树。获得的系统树如图2所示。

图3基于拼接后的miRNA序列利用

从图3可以明显看出被研究的四个物种分为了2支，一支是高等哺乳动物的小家鼠和黑猩猩，另一支为低等的圆口动物海七鳃鳗和低等的头索动物佛罗里达文昌鱼。表明小家鼠和黑猩猩的亲缘关系较近，海七鳃鳗和佛罗里达文昌鱼的亲缘关系较近，它们的支上的自检支持值分别为89%和99%，均大于75%，表明该结果具有很高的可信度。这一分子系统学结果与现行的传统的分类学相一致。①张际峰，汪承润，王顺昌等：《鲥鱼、太湖新银鱼和大银鱼18S rRNA基因的克隆与序列分析》，《武汉大学学报》(理学版)2010年第1期，第87-92页。暗示本研究所基于miRNA进行生物的分子系统学研究具有一定的可行性。

3讨论

由于miRNA作为一种重要的内源性调控因子，其通过调控一至多个靶基因转录和翻译，从而参与众多复杂的生物学过程。miRNA的调控方式主要通过其自身序列与靶基因序列的互补结合，这表明miRNA如果具备其调节功能，必须与其在其靶基因在序列上存在互补性。②Qiu C,Wang J,Yao P,et al,"microRNA evolution in a human transcription factor and microRNA regulatory network",BMC Systems Biology,Vol.4,2010,pp.23-34.靶基因在生物的演化过程中保留了进化痕迹，这可能也会让其存在互补调节序列的miRNA携带有这一进化痕迹（虽然互补的片段可能只是基因序列中的很小一段）。这让miRNA用于物种的进化分析成为了可能，也是本研究基于多个拼接后miRNA序列，获得科学结果的理论依据。

本研究获得的结果虽然推断出miRNA在分子系统学研究方面具有潜在的能力。然而，我们也能看到，本研究构建进化树所选的物种数较少，所选的miRNA的数目也没有超过10条，这些让本文获得的结果少了些说服力。科学地验证更多物种，选择更为合适的miRNA和增加miRNA的数目，有望获得更为理想的结果。

miRNA:a novel marker of molecular phylogenetic study

ZHANG Jifeng，CUI Jiachang

MicroRNAs(miRNA)are the non-coding small molecules whose lengths are about between 21 to 25 nucleotides in eukaryotes.As the important regulatory factors for post-transcriptional gene expression in animals and plants,these are one of frontiers and hotspots of molecular biology research in recent years.However,it is rare to find some reports of using miRNA as molecular markers to go on molecular systematic research.Using the miRBase database,this study collects and stitching miRNA base sequence that exists in many species,using Clustal X 2.0 and MEGA 5.0 to build their molecular system trees.The results got from molecular system phylogenetic trees are consistent with traditional systematic taxonomy,which provides new research ways to explore biological molecular evolution from the perspective of gene regulation.

miRNA;phylogeny;evolutionary analysis

Q78

A

1009-9530（2017）03-0092-03

2017-04-07

安徽省2016年高校优秀青年人才支持计划重点项目“基于生物网络筛查肝癌易感基因研究”（gxyqZD2016264）；2015年度淮南师范学院科学研究产学研重大项目“乳酸关键基因表达调控及酸奶生产工艺改进研究”（2015xj49zd）

张际峰（1979-），男，淮南师范学院生物工程学院讲师，博士，主要从事分子系统学和生物信息学研究。