黄羽肉鸡心包积水-肝炎综合征不同组织中病毒含量的比较

卢受昇，孙彦伟，余希尧，高慧敏，邓国东

（广东省动物卫生监督总所，广东广州 510230）

黄羽肉鸡心包积水-肝炎综合征不同组织中病毒含量的比较

卢受昇，孙彦伟，余希尧，高慧敏，邓国东

（广东省动物卫生监督总所，广东广州 510230）

心包积水-肝炎综合征（HHS）是鸡的一种新发传染病，可导致较高的死亡率，对养鸡业构成重大威胁。本研究应用Taqman荧光PCR检测方法，对一自然病例中病死鸡不同组织样品相对病毒浓度进行了测定。结果显示不同组织平均病毒浓度从高到低依次为：肝＞肺＞脾＞肾＞肠＞气管＞胸腺＞心＞脑＞心胞液＞胰腺＞咽/肛。不同组织间病毒浓度相差较大。其中，肝脏的病毒浓度最高，较其他组织高出约1～4个数量级，故肝脏可作为诊断、监测及疫苗制备的首选靶组织；心胞液中病毒浓度并不高，仅为肝脏的0.22%；拭子样品病毒浓度最低，提示若采用拭子样品进行检测时，漏检的机率较大，需通过增加采样数量等方法来弥补样品灵敏度不足的问题。本研究为该病的监测、诊断和研究提供了依据。

心包积水-肝炎综合征；不同组织；病毒浓度

心包积水-肝炎综合征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS），又称安卡拉病，是鸡的一种危害较大的新发传染病。该病由腺病毒科禽腺病毒属Ⅰ群C种4血清型病毒（Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4）引起。2011年山东省白羽肉鸡首先出现该病[1]。其后，该病在河南、湖北、江苏、安徵、江西等省流行。除白羽鸡外，蛋鸡、黄羽鸡及地方品种均有发病的报道[2-4]。对于此新发传染病，许多发病机理传播机制尚待研究，了解病毒的组织嗜性是疫病防控的重要条件之一。当前，除有鸡胚组织中病毒含量测定的报道外[5]，病死鸡各组织中的病毒分布未见报道。本研究应用荧光定量PCR方法，对自然病例各组织中的病毒含量进行相对定量，旨在明确本病的组织嗜性，为本病的诊断、检测提供依据。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1样品。病死鸡7只，来自某发病鸡场，采集其心、心胞液、肝、脾、肺、肾、胸腺，咽拭子、泄殖腔拭子及十二指肠等组织样品。

1.1.2试剂。荧光PCR预混试剂Premix Ex Taq（Probe qPCR），宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA柱式提取试剂盒，北京世纪元亨产品；FAdV-4引物和探针，自行设计；定量 PCR仪，Lightcycle 480 罗氏公司产品。

1.2方法

1.2.1样品的制备。分3点剪取各种组织共约0.3～0.5 g，电子天平称重，按1:3加入PBS，用微量振荡研磨仪研磨1 min，离心备用；心包液按1:3用PBS进行稀释；拭子样品（加入0.5 mLPBS）浸出液也按1:3用PBS进行稀释。

1.2.2样品的检测。检测用自行建立的荧光PCR方法（另文发表），反应体系与程序为Premix ExTap （2×）10 μL，上、下游引物（10 pmol/ μL）各0.4 μL；探针（10 pmol/μL）1.6 μL；模板3 μL，DEPC水5.6 μL。反应程序为95 ℃预变性 2 min，94℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，5个循环；94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环，60 ℃反应结束后收集荧光。每份样品做3个重复检测。

1.3数据处理分析

将每份样品3次重复检测的荧光PCR反应的CT值取平均值，作为单份样品的检测结果，并计算标准差。为评估不同组织的含毒量差异，对各病死鸡同种组织的CT值进行平均，并进行显著性检验。为更直观地比较不同样品间病毒浓度，将CT值最高（即病毒浓度最低）样品的病毒含量指定为1，以此为基准，计算其他样品与该样品病毒含的比值。因浓度最高样品与参照样品比值过大，将数据取以10为底的对数进行处理。

2 结果

2.1样品PCR检测结果

罗氏 Lightcycle 480 荧光PCR检测图见图1；各样品检测结果见表1。

图1 1～3号鸡样品检测结果

表1各样品检测结果

2.2不同组织病毒含量排序

从平均CT值分析：含量最高的为肝组织，CT值平均为16.81，含量最低的为咽肛拭子样品，CT值平均为28.95，差异较大。其他不同组织间也存在病毒含量差异。按平均CT值统计病毒含量，由高到低的排序依次为肝＞肺＞脾＞肾＞肠＞气管＞胸腺＞心＞脑＞心胞液＞胰腺＞咽/肛拭子（表1）。其中肝中的病毒含量最高；其次为肺、脾；再次为肾、肠、气管、胸腺、心、脑、心胞液、胰腺等；最低为拭子样品。

2.3各组织间相对病毒含量分析

2.3.1不同鸡只的病毒含量差较大。如图2所示，该自然发病病例中，可分为3种类型：一是高病毒含量型，各组织中病毒含量均高，组织间的差异相对较小，例如1、5、6号鸡；二是中等病毒含量型，除肝组织中病毒含量较高外，其他组织中的含量相对较低，差异较大，例如2、3号鸡；三是低病毒含型，各组织中病毒含量均低，肝组织中的病毒含量也不突出，咽/肛拭子中的病毒含量相对较高，例如4、7号。在自然病例中，由于个体感染的病毒量、感染时间、其他常规细菌继发感染与否，以及所处病程阶段的不同，导致病毒含量的个体差异较大。

2.3.2不同组织间病毒含量差异较大。病毒含量最高的1号鸡肝组织样品是最低的7号鸡的胰腺样品的56.84万倍（105.75）。就7只鸡均值而言，肝较肺、脾高出1～2个数量级（分别为17.67和27.71倍）；较肾、肠、气管、胸腺和心等高出2个数量级（分别为103.82、128.27、142.32、166.01和190.51倍）；较脑、心胞液和胰腺等高出2～3个数量级（分别为384.37、456.56和508.46倍）；较拭子样等样品高3～4个数量级（分别为4 491.56、4 496.75倍）。

3 讨论与结论

当前该病毒分离培养尚无灵敏度高方法。鸡胚接种效率较低，对病毒量不高的样品很难培养成功。普通PCR方法灵敏度亦有限，并且进行相对定量难度较大，故本实验选用自行建立的敏感性较高荧光PCR方法。因个体差异的存在，需对多个个体的均值来对各组织的病毒含量进行评估。而样品数量较多，每个样品又有3个重复，受仪器通量限制无法同时进行检测，因此在确保同一个体的样品置于同一反应中进行的基础上，所有荧光PCR反应液是统一配置分装，并在同一台仪器上进行检测，这在一定程度上解决了各鸡只间的可比性问题。

本检测结果表明，肝脏是病毒含量最高的组织，含量分别是排在第2、3位的肺、肾等组织的17.67、27.71倍，较其他组织中的病毒含量高出更多。故本研究说明肝脏是该病诊断采样组织的首选，也是制备疫苗等其他生物制品的首选组织。本病一大特征为包涵体肝炎，肝脏中有多量病毒聚集成光学显微镜可见的包涵体，在其他器官中未见，这也是肝脏中含毒量高的另一种表现形式。邱丽叶等[5]对接种病毒后鸡胚组织中病毒含量进行测定，也有类似的结果，但随接种途径不同，组织嗜性有所不同，经卵黄囊途径和尿囊腔途径，病毒的主要嗜性组织为肝脏，经尿囊膜途径接种，病毒的主要嗜性组织为尿囊膜，其中卵黄囊途径FAdV增殖能力最强。

图2各种组织相对病毒浓度

除肝炎外，本病的另一解剖病变特点为心包积液。但心包液中病毒含量并不高，只略高于胰腺和咽/肛拭子样品，仅为肝脏的0.22%，这一点出乎意料。同时，接种鸡胚进行病毒分离时，尿囊液中病毒含量也不高，这是否能说明本病毒具有不易进入体液的特性，尚有待进一步研究。

拭子样品中的平均病毒含量最低。呼吸道、消化道是病毒排出体外的重要途径。而咽/泄殖腔拭子样品采集便捷，无损伤，成为家禽疫病病原学监测的理想样品。但本研究表明拭子样品中的病毒含量低，提示用拭子样品进行检测，出现漏检的几率较大。但本研究中发现个别鸡只的拭子样品病毒含量较高，如7号鸡的肛拭子和4号鸡的咽/肛拭子样品，说明检测过程中可通过扩大采样数量来解决样品灵敏度不足的问题。

[1] CHOI K S，KYE S J，KIM J Y，et al. Epidemiological investigation of outbreaks of fowl adenovirus infection in commercial chickens in Korea [J]. Poultry Science，2012，91：2502-2506.

[2] 常维山，王涛. 鸡心包积液综合征（安卡拉病）病原分离检测[J]. 中国动物保健，2015，17（12）：25-26.

[3] YE J Q，LIANG G C，ZHANG J J，et al. Outbreaks of serotype 4 fowl adenovirus with novelgenotype，China [J]. Emerging Microbes and Infections，2016，5（5）：50-51.

[4] 罗玲，赵康，张媛，等. 鸡心包积水综合征病原的分离与鉴定[J]. 中国禽业，2016，38（6）：56-58.

[5] 邱丽叶，李慧昕，王娟，等. 不同接种途径对禽腺病毒在鸡胚中增殖的影响[J]. 中国预防兽医学报，2016，38（4）：275-278.

（责任编辑：朱迪国）

Comparison of Virus Content in Different Tissues of Hydropericardium Hepatitis Syndrome in Yellow Broiler Chickens

Lu Shousheng，Sun Yanwei，Yu Xiyao，Gao Huimin，Den Guodong
（Guangdong Animal Health Supervision Institution，Guangzhou，Guangdong 510230）

Hydropericardium hepatitis syndrome（HHS）is a novel infectious disease，causing huge economic losses in the poultry industry. In this paper，with Taqman real-time PCR method，the relative virus concentrations in different tissue samples of a natural case dead chickens were measured. The results showed that the average concentration of virus in different tissues in order from high to low were：liver＞ lung ＞ spleen ＞ kidney ＞ intestine ＞ trachea ＞ thymus ＞ heart＞ brain ＞ cardiac fl uid ＞ pancreas ＞ throat /anal swab. The virus concentration among different tissues varied greatly，in which the liver virus concentration was the highest，higher than the other tissues of about 1 to 4 in the order of 10 magnitude. So liver can be used as the preferred target tissue of diagnosis，monitoring and vaccine preparation. The virus concentration of heart cytosol was not high，only 0.22% of the livers. Swab samples of virus were the lowest. It was suggested that if the swab samples were monitored，the probability of missed detection was greater，and it was necessary to increase the number of samples and other methods to make up for the lack of sample sensitivity. This paper provides a basis for the monitoring，diagnosis and research of the disease.

Hydropericardium hepatitis syndrome；different tissues；virus concentration

S851.3

B

1005-944X（2017）08-0104-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.027