一例猪链球菌2型感染的病原分离鉴定及药敏试验

2017-08-07 22:48惠艳华沈莉萍叶慧萍施蔡培成建忠鄢志刚张维谊
中国动物检疫 2017年8期
关键词:猪链球菌血清型阿莫西林

惠艳华,丁 宁,沈莉萍,叶慧萍,施蔡培,成建忠,鄢志刚,张维谊

(1.上海市崇明区动物疫病预防控制中心,上海 202150;2.上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103)

一例猪链球菌2型感染的病原分离鉴定及药敏试验

惠艳华1,丁 宁1,沈莉萍2,叶慧萍1,施蔡培1,成建忠1,鄢志刚1,张维谊2

(1.上海市崇明区动物疫病预防控制中心,上海 202150;2.上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103)

2016年2月,上海市崇明区某乡镇一规模养猪场出现40多头5~8周龄仔猪发病死亡情况。经细菌分离、分离菌株生化鉴定和PCR检测,确诊为猪链球菌2型感染。对该菌株采用K-B纸片法,进行10种常用抗菌药物的体外药敏试验,结果发现该细菌对青霉素、阿莫西林、恩诺沙星敏感,对诺氟沙星、阿奇霉素、壮观霉素、卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素和氨苄西林不敏感。根据药敏试验结果,建议养猪户使用阿莫西林和恩诺沙星进行治疗,并做好病猪的隔离与护理。一周后病情得到控制。

猪链球菌病;猪链球菌2型;分离鉴定;PCR

猪链球菌病是由猪链球菌引起的人兽共患传染病,在世界各地均有发生[1],近年来在养猪场的流行呈上升趋势,给养猪业造成巨大的经济损失[2]。猪链球菌据其荚膜抗原差异,至少可分为35种血清型,大多数致病性血清型为1~9血清型,其中血清2型为最常见和毒力最强的血清型[2]。

1 发病情况及临床症状

2016年2月,上海市崇明区某乡镇一规模养猪场出现40多头5~8周龄仔猪发病死亡情况,发病20多天,死亡35头。病猪临床表现为食欲不振、消瘦、跛脚、后肢关节肿大、个别猪腹泻等症状,使用双黄连、头孢噻呋钠等肌肉注射,结果疗效不明显。

2 剖检病变

病死猪剖检病变主要表现为心脏与胸腔粘连、心脏表面有纤维素渗出物、腹腔积液、肝脏及颌下淋巴结肿大、后肢关节有透明积液等。

3 实验室诊断

3.1细菌分离

将无菌采集的病死猪心、肝、脾、肺和关节积液接种于哥伦比亚血琼脂平板(购自北京陆桥技术股份有限公司),在5% CO2培养箱中经36 ℃培养24 h,结果均生长出灰白色、圆形凸起、半透明、草绿色溶血的小菌落,革兰氏染色为G+球菌,成双或链状排列,触酶试验阴性。

3.2分离菌株生化鉴定

委托上海市动物疫病预防控制中心对分离菌株进行鉴定,按照GP鉴定卡操作步骤进行操作,并在VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪上读取鉴定结果。细菌鉴定结果为471051364313571,猪链球菌Ⅱ(Streptococcus suisⅡ),鉴定准确率96%,生化特性详见表1。

3.3PCR诊断

3.3.1细菌基因组DNA提取。用煮沸法制备DNA 模板,挑取数个菌落于含100 μL ddH2O的EP管中,100 ℃水浴10 min,12 000 r/min 离心5 min,吸取上清作为模板,置-20 ℃保存备用。

3.3.2引物合成、反应体系和条件。参照文献[4]合成猪链球菌通用和猪链球菌2型(表2),PCR反应体系均为25 μL。反应体系:premix 12.5 μL,引物各0.5 μL,ddH2O 8.5 μL,模板2 μL;反应条件为:94℃预热5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,扩增30个循环;72 ℃延伸10 min。将ATCC43765、HA9801为阳性对照,灭菌纯水为阴性对照。

3.3.3电泳及结果。经1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果在分离菌株(重复2份)DNA中扩增出与阳性对照一致目的条带,而阴性对照无条带(图1)

表1分离菌株生化特性

表2猪链球菌PCR引物序列

图1 分离菌PCR扩增电泳结果

3.4血清型鉴定

使用丹麦的猪链球菌2型标准血清(批号为psu2-2-3),采用玻片凝集试验进行检测,结果分离菌株与猪链球菌2型标准血清发生凝集。

3.5药敏试验

将细菌纯培养物采用K-B纸片法,对10种常用抗菌药物进行体外药敏试验,36 ℃培养24 h观察结果。实验方法及判读标准参照NCCLS 2010标准。结果该细菌对青霉素、阿莫西林、恩诺沙星敏感,对诺氟沙星、阿奇霉素、壮观霉素、卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素和氨苄西林不敏感。

4 结果

结合病猪临床症状、剖检变化及实验室检测结果,该病例可以确诊为猪链球菌2型感染。根据药敏试验结果,建议养猪户使用阿莫西林和恩诺沙星进行治疗,并做好病猪的隔离与护理。一周后回访,病情已得到控制。

5 讨论

链球菌种类多,属条件性致病菌,在自然界和猪群中广泛分布。随着规模化养猪业的发展,猪链球菌病已成为养猪生产中的常见病和多发病,但大多数在3~12周龄的仔猪中暴发流行。在猪链球菌众多血清型中,2型是猪的最主要病原,致病性最强,同时其对人的致病性也最强。

猪链球菌病虽为细菌病,但对养猪业的危害却不容小觑,同时因猪链球菌病是人兽共患病,所以在生猪养殖过程中,饲养人员要加强个人防护,有外伤时应尽量避免接触病猪。发病猪场应加强饲养管理及消毒工作,对病猪隔离治疗,同时提高猪群的营养水平。该病临床上常用β内酰胺类和氟喹诺酮类药物进行治疗,但因青霉素易产生耐药性,建议将其只用于敏感菌株所致疾病的治疗[5],最好根据药敏试验结果来指导用药。

根据发病情况、临床症状和细菌培养及染色镜检等,能够初步判断猪感染链球菌疑似感染,但要确诊需进一步试验。本次通过多重PCR方法检出了猪链球菌,证明多重PCR方法具有简便、快速,以及特异性和敏感性良好等优点,适合基层单位应用于链球菌的临床鉴定。

[1] 赵云玲,王君玮,王华.猪链球菌2型检测技术概述[J].中国动物检疫,2009,26(10):

[2] 赵冉,孙建和,陆承平.多重PCR鉴定猪链球菌2型毒力菌株[J].上海交通大学学报(农业科学版),2006,24(6):503-507.

[3] 祁金汉,张其祝.猪链球菌病的检疫检验[J].中国畜牧兽医文摘,2016,32(11):123.

[4] 李小军.上海地区猪致病性链球菌及其毒力基因的检测[D]. 南京:南京农业大学,2007.

[5] BARBARA E S. 猪病学[M]. 9版. 赵德明,张仲秋,沈建忠,主译. 北京:中国农业大学出版社,2008:882.

(责任编辑:朱迪国)

Isolation,Identif i cation and Drug Sensitivity Test on Strains of Swine Streptococcus suis type 2 Isolated from a Case of Swine Streptococcosis

Hui Yanhua1,Ding Ning1,Shen Liping2,Ye Huiping1,Shi Caipei1,Cheng Jianzhong1,Yan Zhigang1,Zhang Weiyi2
(1. Chongming Animal Disease Prevention and Control Center,Shanghai 202150;2. Shanghai Animal Disease Prevention and Control Center,Shanghai 201103)

More than 40 piglets of 5~8-week-old were dead in a scaled swine farm in a township of Chongming district,Shanghai city,in 2016 February. The diagnosis of Streptococcus suis type 2 infection was confirmed by bacterial isolation,biochemical identif i cation and PCR detection. The vitro drug sensitivity test of 10 kinds of antibacterial drugs against to the strain were done by K-B method,the results showed that it was insensitive to Penicillin,Amoxicillin,Enrofloxacin,Norfloxacin,Azithromycin,Spectinomycin,Kanamycin,Amikacin,Gentamicin and Ampicillin. According to the results of drug sensitivity test,suggestions were put forward to treat the diseased swine with Amoxicillin and Enrof l oxacin,and to do good isolation and nursing care of sick swine. A week later,the illness was controlled.

Swine streptococcosis;Streptococcus suis type 2;isolation and identif i cation;PCR

S851.3

B

1005-944X(2017)08-0097-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.025

上海市生猪产业技术体系建设(沪农科产字〔2016〕第6号)

成建忠

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