针刺血清对成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响

王亚军 浪万英 宋亚文 张来举 宋凯

1.甘肃中医药大学针灸推拿学院，甘肃 兰州 730000 2.甘肃中医药大学针灸推拿学院2014级硕士研究生,甘肃 兰州 730000

近些年，我国患骨质疏松症的人数呈上升趋势，且因其严重的症状引起医学人士的关注[1-3]。为此，医学专业人员不断探索，寻求有效的防治方法。其探索范围主要涉及西药、中医药以及运动和饮食疗法。其中中医治疗方法中，针灸显示了其独特的治疗优势[4，5]。因此，医学研究人员开始对针灸治疗骨质疏松症的效果及其机理进行研究总结[6，7]。本文从基因水平研究了针刺血清对去卵巢大鼠骨形成和骨吸收活性的影响，为后续研究针刺治疗骨质疏松症提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

电针(上海华谊医用仪器有限公司)；双能X线骨密度测定仪(美国GE公司)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司 批号：199A3)；兔IgG-免疫组化试剂盒SABC即用型(博士德生物工程有限公司 批号：SA1022)；大鼠OPG原位杂交检测试剂盒(博士德生物技术有限公司 批号：MK2149)；大鼠RANKL原位杂交检测试剂盒(博士德生物技术有限公司 批号：MK2100-r)；大鼠成骨细胞专用培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司 批号：CM-R091)；PBS液(北京雷根生物技术有限公司 批号：0111/A16)；通用细胞冻存液(北京雷根生物技术有限公司 批号：0111A16)；过氧化物酶阻断液(博士德生物工程有限公司 批号：11C17B08)；DAB显色试剂盒(博士德生物技术有限公司 批号：11B23C22)； 载玻片(中国制造批号：CAT.7101P)；显微镜盖玻片(中国制造 批号：10212020C)；针灸针(苏州医疗用品厂，0.35 mm×13 mm，0.5寸)。

1.2 方法

1.2.1骨质疏松症模型大鼠的制备方法

选取SPF级2月龄SD雌性大鼠48只，随机分为药物组、针刺组、模型组和空白组，每组12只。将大鼠以0.3 mL/100 g的10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，在其最末肋骨下一横指且旁开脊柱有一小的隆起处，剃去此处鼠毛，铺无菌洞巾，以碘酊消毒。切开皮肤、背部肌肉、腹膜，以小镊子轻轻将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到粉色菜花样卵巢。先将卵巢下端输卵管用丝线结扎，然后摘除卵巢。切口缝合后，对皮，碘酊消毒，同法摘除另一侧卵巢，造成骨质疏松症模型大鼠；空白组不切除[8]双侧卵巢。造模后饲养3个月，检测骨密度和骨矿物含量。检测结果显示造模成功，见表1、表2。

组别nBMD(g/cm2)空白组120.172±0.003模型组120.157±0.012∗∗

注：与空白组相比，**P<0.01，差异具有统计学意义。
Note: Compared with the blank group,**P<0.01, statistically significant.

组别nBMC(g/cm2)空白组1219.62±0.017模型组1218.54±0.058∗∗

注：与空白组比较，**P<0.01，差异具有统计学意义。
Note: Compared with the blank group,**P<0.01, statistically significant.

1.2.2动物处理方法

空白组：不予任何处理，常规饲养。

模型组：灌服与药物组同体积的蒸馏水，常规饲养。

药物组：按照1 mL/100 g标准灌胃给予0．02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液(大鼠给药剂量按照人与大鼠体表面积比值折算而得)[9]，1次/1天，连续治疗5天，间隔2天。20天1疗程，治疗3疗程。

针刺组：“三阴交”穴位于后肢内踝尖直上10 mm，直刺5 mm；“足三里”穴位于膝关节下侧，腓骨小头下缘5 mm处，直刺5 mm；“脾俞”穴位于第十一胸椎棘突下旁开1.5寸，直刺5 mm；“肾俞”穴位于第2腰椎棘突下旁开1.5寸，直刺5 mm。以大鼠脚趾中指和同身寸法确定旁开位置和针刺深度。剃去背部鼠毛，应用针具及穴位常规消毒后，用30号0.5寸不锈钢毫针快速刺入皮下一定深度，接入电针，频率为2Hz，断续波[10-12]，刺激强度1.0mA，以局部见肌肉轻微收缩为佳，每次15 min。同时灌服与药物组同体积的蒸馏水，1次/1天，连续治疗5天，间隔2天。20天1疗程，治疗3疗程。

1.2.3大鼠全身骨密度检测

治疗3个疗程后，采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉各组大鼠。待至大鼠处于全身迷醉状态下(用拇指和食指掐其尾端，如果大鼠没有甩尾动作，显示达到最佳测定时段)，将其依次置于骨密度测定仪器。将大鼠置于测定板上，使四肢，尾部全部集中于测定板上，使头部，躯体和尾部处于测定板的纵端中线上，避免偏移，并使全身处于伸展状态。扫描全身，采用计算机显示大鼠全身骨影像，保存扫描图片，抄录检测数据[13-15]。

1.2.4大鼠成骨细胞的体外培养

将SD大鼠乳鼠(来自甘肃中医药大学SPF级实验室)置于75%酒精中浸泡处死，无菌条件下取其颅骨并去除骨膜及结缔组织，PBS 清洗3次；将骨片剪碎(大小约1 mm×1 mm×1 mm)，转移至培养瓶中，0.25%胰酶消化2 次(37 ℃，每次10 min)，弃去上清液，0.1% 的Ⅱ型胶原酶消化10 min，弃上清；再用0.1% 的Ⅱ型胶原酶消化4 次(37 ℃，每次20 min)，收集合并上清液，加入5 mL含血清的培养基中止酶消化，150目滤网过滤3次，1 000 r /min离心10 min；弃上清，加入培养基(α-MEM培养基，内含10% PBS)，吹打均匀并计数。原代细胞悬液以3×104/mL接种于大皿(Nunc) 中培养，每皿10 mL，37 ℃、5%CO2和饱和湿度的条件下培养，每3 d换液1 次。待细胞铺满80%培养皿后进行爬片培养。

1.2.5成骨细胞的血清处理方法

采用10%水合氯醛(0.03 mL/100 g)麻醉各组大鼠，待大鼠麻醉充分后，用5 mL真空采血针对准心脏部位扎取一定量血液，冷置1 h，离心(2 500 r/min，25 min)，弃去沉淀物，保留上层血清。将上层血清采用56 ℃水浴灭活30 min，并用0.22 μm的滤网抽滤除菌。将各组制备血清依10%的比例加入爬片培养的成骨细胞3天后，4%多聚甲醛固定10 min。采用原位杂交法处理各组细胞爬片，并通过图像分析处理软件IPP选取恰当视野，提取灰度值，结果采用积分光密度(IOD)表示。

1.2.6原位杂交方法

(1)OPG mRNA的检测

运用针对Osteoproteogrin(OPG)的寡核苷酸探针，经地高辛标记，采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术，并配合使用敏感性加强型的原位检测方法。针对大鼠OPG靶基因的mRNA序列为：

(1)5’——TGGAC AACCC AGGAA ACCTT TCCTC CAAAA——3’

(2)5’——TTTGC CTGGG ACCAA AGTGA ATGCA GAGAG——3’

(3)5’——AGAAA TGATA GGGAA TCAGG TTCAA TCAGT——3’

将成骨细胞爬片采用4%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6),含有1/1000DEPC,室温固定20-30分钟，蒸馏水充分洗涤，干燥后-20 ℃冰箱保存备用。

30%H2O21份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟，蒸馏水洗涤2次。

暴露mRNA核酸片段：爬片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1 mL 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，室温消化5-120秒。PBS洗3次×5分钟，蒸馏水洗1次。

后固定：4%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6),含有1/1000DEPC,室温固定10分钟，蒸馏水洗涤3次。

预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20 mL以保持湿度，每张爬片20 μL加预杂交液，恒温箱38 ℃-42 ℃，2-4小时，吸取多余液体，不洗。

杂交：按每张爬片20 μL杂交液，加在爬片上，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在爬片上，恒温箱38 ℃-42 ℃杂交过夜。

杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37 ℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次。

滴加封闭液：37℃30分钟，甩去多余液体，不洗。

滴加生物素化鼠抗地高辛：室温120分钟，PBS洗5分钟×4次。

滴加SABC:室温30分钟，PBS洗5分钟×3次。

滴加生物素化过氧化物酶：室温30分钟，PBS洗5分钟×4次。

使用DAB显色后流水清洗，乙醇梯度脱水，树脂封片，拍照采集照片。

(2)RANKL mRNA的检测

运用针对RANKL的寡核苷酸探针，经地高辛标记，采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术，并配合使用敏感性加强型的原位检测方法。针对大鼠RANKL靶基因的mRNA序列为：

(1)5’——TACTT TCGAG CGCAG ATGGA TCCTA ACAGA ATATC——3’

(2)5’——TTGGT ACCAT GATCG AGGCT GGGCC AAGAT CTCTA——3’

(3)5’——GATCC GGATC AAGAT GCGAC GTACT TTGGG GCTTT——3’

检测步骤同上。

1.2.7统计学处理

2 结果

2.1 大鼠全身骨密度BMD检测结果

如表3所示，与空白组相比，模型组全身BMD显著降低(P<0.01)，说明去卵巢骨质疏松大鼠模型建立成功。经过药物或针刺处理后，BMD显著升高，与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。

组别nBMD(g/cm2)空白组120.179±0.001∗∗模型组120.156±0.005药物组120.169±0.034∗∗针刺组120.170±0.001∗∗

注：**P<0.01，差异具有统计学意义。
Note:**P<0.01, statistically significant.

2.2 大鼠全身骨矿物含量BMC检测结果

如表4所示，与空白组相比，模型组全身BMC显著降低(P<0.01)，说明去卵巢骨质疏松大鼠模型建立成功。经过药物或针刺处理后，BMC显著升高，与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。

组别nBMC(g/cm2)空白组1222.213±0.016∗∗模型组1218.550±1.086药物组1220.038±2.105∗∗针刺组1220.213±1.267∗∗

注：**P<0.01，差异具有统计学意义。
Note:**P<0.01, statistically significant.

2.3 大鼠血清处理后成骨细胞OPG mRNA表达结果

如图1所示，其中空白组OPG mRNA表达量最高，模型组最低，经过药物或针刺处理后，OPG mRNA表达显著升高，与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。

图1 各组成骨细胞OPG mRNA表达情况注：与模型组相比，**P<0.01，具有统计学意义。Fig.1 OPG mRNA expression in osteoblasts of each groupNote: Compared with the model group, **P<0.01，statistically significant.

2.4 大鼠血清处理后成骨细胞RANKL mRNA表达结果

如图2所示，其中空白组RANKL mRNA表达量最低，模型组最高，经过药物或针刺处理后，RANKL mRNA表达显著下降，与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。

图2 各组成骨细胞RANKL mRNA表达情况注：与模型组相比,**P<0.01，具有统计学意义。Fig.2 RANKL mRNA expression in osteoblasts of each groupNote: Compared with the model group,**P<0.01，statistically significant.

3 讨论

笔者在查阅有关针灸治疗骨质疏松症的研究[16-18]中发现，大多数研究集中在探究针刺对骨质疏松症大鼠生化、骨密度、生物力学、蛋白和基因等方面，其研究结果亦证实针灸确实能明显改善患者的临床骨质症状。在此基础上，本课题结合了“针灸血清学”研究方法并进一步探索。实验研究结果表明，药物和针刺对去卵巢骨质疏松症模型大鼠均能取得疗效。从成骨细胞骨重建方面来讲，针刺血清能从基因水平影响成骨细胞OPG，RANKL的表达，从而调节骨重建和骨破坏环节的平衡。因此，该实验结果为临床上针灸治疗多种原因导致的骨质疏松症提供理论支持。

中医学理论认为，肾主骨生髓，脾主四肢肌肉，肝主筋。因此本研究依据实验动物针灸学选取了最具调节肝脾肾三脏功能的穴位，同时设立阳性药物组与之形成对比。探究结果进一步深化了以往研究结果，给针灸治疗骨质疏松症的理论研究再添新象，亦能更好地支持临床采用针灸推拿治疗骨质疏松症。与此同时，希望该领域研究人员能更深入探索运用针灸骨质疏松症的实质性内容[19-21]。