大连地区中老年人25-羟维生素D和同型半胱氨酸与骨质疏松症相关性研究

吕璘琳 孙芹敏 杨春 孙国华 韩青 陈阵 李士军*

1.大连医科大学附属第一医院检验科，辽宁 大连 116011 2.大连医科大学附属第一医院核医学科，辽宁 大连 116011

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以骨量减少，骨质量受损及骨强度降低，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病[1]。骨质疏松症是一种退化性疾病，严重困扰、危害老年人的健康，发病率随年龄增加而增加。我国40岁以上人群每年骨质疏松症发病率约为20%～25%，患病人数约1.4亿，年龄每增加10岁骨质疏松症发病率男性增长约15%，女性增长约21%[2，3]。我国60岁以上老年人的骨质疏松发病率为56%，有的地区更高达70.9%，绝经后妇女发生率更高，约为60%～70%，甚至达78.6%[4，5]。2010年美国50岁以上人群约有1020万人患骨质疏松症，4340万人患骨量减少，预计到2030年患骨质疏松症和骨量减少的人将增加到1360万和5780万[6]。骨质疏松症的最大危害是发生骨质疏松性骨折(OPF), 腰椎和髋部骨折致残致死率高，严重影响老年人的生活质量。北京等地区基于影像学的流行病学调查显示，50岁以上妇女脊柱骨折的患病率为15%；北京市50岁以上髋部骨折发生率十年间男性和女性分别增加43%和110%[7]。维生素 D缺乏被认为是OP和OPF发生发展的重要危险因素[7]。近年来有研究发现，作为心血管病危险因素得到普遍认可的高同型半胱氨酸血症也与骨质疏松症及其脆性骨折相关[8-10]。25(OH)D是评估维生素 D营养状态的最佳指标[11]。骨质疏松性骨折的发生与骨强度下降有关，而骨强度是由BMD和骨质量所决定，其中BMD约反映骨强度的70%,目前临床上采用BMD测量作为诊断OP、预测OPF风险、监测自然病程以及评价药物干预疗效的最佳定量指标[7]。本研究旨在探讨25(OH)D和Hcy与BMD、OPF之间的关系，以期为预防骨质疏松症和骨质疏松性骨折提供早期临床干预的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 病例选择

研究对象来自2015年9月-2016年10月大连医科大学附属第一医院骨科、核医学科就诊患者和体检中心体检者。共选取210例研究对象，筛选条件为：男性年龄≥50岁，女性为绝经后且年龄≥46岁，并且排除患有影响骨代谢的各种慢性疾病(肾、肝、甲状旁腺、甲状腺疾病、高催乳素血症、卵巢切除、类风湿关节炎、糖尿病、恶性肿瘤、血液疾病等)、服用过影响骨代谢药物(糖皮质激素、雌激素、甲状腺激素、甲状旁腺激素、双膦酸盐、降钙素、噻嗪类利尿药、免疫抑制剂等)和6个月内服用过钙剂、维生素 D、叶酸、维生素B12、维生素B6的对象。

1.2 研究方法

1.2.1分组：全部研究对象均接受美国HOLOGIC Discovery A型双能X线测定仪(DXA)对腰椎(1-4)骨密度 (total lumbar spines BMD 1-4，BMD-L)，髋部骨密度(total hip BMD，BMD-H)和骨股颈骨密度(femoral neck BMD， BMD-N)的检测。210例实验对象被分为骨质疏松组(包括骨质疏松和严重骨质疏松)78例(男23例，女55例)，年龄50-90岁；骨量减少组73例(男34例，女39例)，年龄46-80岁；骨量正常组59例(男28例，女31例)，年龄46-81岁。分组依据为 2011年中华医学会骨质疏松和矿盐疾病分会《原发性骨质疏松症诊治指南》和2004年世界卫生组织(WHO)推荐标准:绝经后女性和50岁以上男性使用DXA测得的骨密度，参照正常成人峰值骨密度T值的标准方差(SD)，BMD-L、BMD-H、BMD-N任意一个部位骨密度T值≥-1.0 SD为骨量正常，-2.5 SD

1.2.2生化指标：在本研究中我们测定了骨代谢部分生化指标，包括钙磷代谢调节指标25羟维生素 D[25(OH)D]、钙(Ca)、磷(P)和骨形成标志物碱性磷酸酶(ALP)[12]，还测定了血清同型半胱氨酸(Hcy)、镁(Mg)、葡萄糖(GLU)、肌酐(Crea)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)。用含有促凝剂的真空采血管采集研究对象清晨空腹静脉血3 mL，离心取血清，-80 ℃冰箱保存，待测。25(OH)D用ROCHE cobas 601检测，Hcy、Ca、P、Mg、ALP和GLU、Crea、ALT用日立7600-210测定。

1.3 统计学方法

使用SPSS17.0统计学软件对数据进行分析处理。Hcy为非正态分布数据，经自然对数转换为正态分布数据LnHcy。正态及近似正态分布数据以均值 士 标准差表示，组间比较用单因素ANOVA和LSD(L)检验；非正态分布数据采用中位数(25%位数，75%位数)表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Mann-Whitney U检验。以P<0.05为有统计学意义。生化指标与骨密度的单因素相关性用Pearson分析，多因素分析用多元线性回归。女性骨折多因素分析采用Logistic二元回归分析。

2 结果

2.1 各组间生化指标及 BMD比较

2.1.1总体比较(表1)

本研究人群血清25(OH)D水平变化范围从4.09～42.56 ng /mL。骨质疏松组25(OH)D显著低于骨量减少组和骨量正常组(P=0.001,P=0.000)；骨量正常组和骨量减少组25(OH)D比较差异没有统计学意义。血清Hcy水平变化范围从4.73～52.18μmol/L。LnHcy在骨质疏松组与骨量正常组比较(P=0.044)差异有统计学意义，与骨量减少组比较(P=0.068)差异没有统计学意义。骨质疏松组与骨量正常组比较Ca、Mg、ALP、年龄差异有统计学意义(P=0.004,P=0.020，P=0.000，P=0.000)。P、GLU、Cre、ALT各组间差异无统计学意义。

表1 血清生化指标及骨密度在各组中的比较Table 1 Comparison of plasma biochemical indices and BMD among the three groups

2.1.2男性和女性分组比较(表2、3)

男性和女性25(OH)D在骨质疏松组与骨量减少组(P=0.047，P=0.005)和骨量正常组(P=0.000，P=0.043)比较差异均有统计学意义；与总体比较不同的是，男性LnHcy各组间差异无统计学意义(P=0.201)，但对于女性骨质疏松组与骨量减少组(P=0.020)和骨量正常组(P=0.040)比较差异有统计学意义。需要强调的是，三组间年龄差异在女性有统计学意义(P=0.000)而男性没有(P=0.344)。男性各部位BMD、25(OH)D和LnHcy均高于女性，且有统计学意义(P<0.05)。

表2 血清生化指标及骨密度在男性各组间的比较Table 2 Comparison of plasma biochemical indices and BMD among the three groups in males

与骨量正常组比较▲P< 0.05，▲▲P< 0.01；与骨量减少组比较#P< 0.05，##P< 0.01。
Osteoporosis vs Normal bone mass▲P< 0.05,▲▲P< 0.01；Osteoporosis vs Osteopenia#P< 0.05,##P< 0.01.

表3 生化指标及骨密度在女性各组间的比较Table 3 Comparison of plasma biochemical indices and BMD among the three groups in females

与骨量正常组比较▲P< 0.05，▲▲P< 0.01；与骨量减少组比较#P< 0.05，##P< 0.01。
Osteoporosis vs Normal bone mass▲P< 0.05,▲▲P< 0.01；Osteoporosis vs Osteopenia#P< 0.05,##P< 0.01.

2.2 25(OH)D和骨密度的关系

2.2.1男性和女性25(OH)D和各部位骨密度Loess拟合图(图1)

图1显示男性和女性各部位骨密度总体上均随25(OH)D水平升高而增加。在25(OH)D<14-16 ng /mL时，各部位骨密度均随25(OH)D水平升高而明显呈线性增加，女性尤其明显； BMD-L和BMD-H略下降后在25(OH)D=20-23ng /mL左右时继续随25(OH)D升高而呈线性增加，女性BMD-L增加不明显；男性BMD-N在25(OH)D=20ng /mL左右时达峰值后趋于平稳，女性BMD-N在25(OH)D=15ng /mL左右时达峰值后趋于平稳，提示男性25(OH)D < 20ng /mL时和女性25(OH)D < 15ng /mL时BMD-N 随 25(OH)D水平升高而明显增加，两者呈显著正相关。

图1 男性和女性25(OH)D和各部位BMD的LOESS拟合图Fig.1 Loess regression plots of BMD by 25(OH)D in males and females

2.2.2相关分析

Pearson相关分析显示(表4)：男性和女性 25(OH)D与BMD-L、BMD-N、BMD-H均呈正相关；男性年龄与BMD-N和BMD-H呈负相关；女性年龄与各部位BMD和25(OH)D均呈负相关。

表425(OH)D、Hcy等生化指标与骨密度的相关系数
Table4Pearson’s correlation coefficients between 25(OH)D, Hcy, BMD, and other biochemical indices

男性Male女性FaemaleBMD-L BMD-N BMD-H25(OH)DLnHcyBMD-L BMD-N BMD-H25(OH)DLnHcy25(OH)Dr0.2550.256 0.315 0.206 0.2930.271P0.0190.0180.003->0.050.0210.0010.002->0.05LnHcy r-0.194P>0.05>0.05>0.05>0.05->0.050.031>0.05>0.05-Car0.223 0.369 0.2290.226P>0.050.0400.0010.035>0.050.011>0.05>0.05>0.05>0.05Pr0.208P>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05 0.020>0.05>0.05Mg r0.394 0.210 0.227 0.262P>0.05>0.05>0.050.000>0.050.0190.011>0.050.003>0.05ALPr-0.257 -0.298-0.221 -0.253 -0.246 -0.266 -0.2370.200P0.0180.0060.0420.019>0.050.0060.0030.008>0.050.025Ager0.2320.219-0.493 -0.522 -0.454-0.2990.423 P>0.050.0320.044>0.05>0.050.0000.0000.0000.0000.000

以25(OH)D、年龄、LnHcy、Ca、P、Mg和ALP为自变量，以BMD-L、BMD-N、BMD-H分别为因变量做多元线性回归分析(Backwad)，男性(表5)25(OH)D 与BMD-L(P=0.064)、BMD-H(P=0.074)近似正相关，与BMD-N不相关，从Loess图可知25(OH)D 与BMD-L、BMD-H近似直线相关，而25(OH)D与BMD-N是非直线相关。因此在25(OH)D <20 ng /mL和25(OH)D ≥20 ng /mL时分别对BMD-N做多元线性回归分析，结果在25(OH)D <20 ng /mL时，男性25(OH)D与BMD-N呈显著正相关。女性(表6)25(OH)D 只与BMD-H(P=0.072)近似正相关，与BMD-L、BMD-N不相关，从loess图可知25(OH)D 与BMD-H近似线性相关，而25(OH)D与BMD-L、BMD-N呈非线性相关。因此在25(OH)D <15 ng /mL和25(OH)D ≥15 ng /mL时对BMD-L、BMD-N分别做多元线性回归分析，结果25(OH)D <15 ng /mL时，女性25(OH)D与BMD-L、BMD-N均呈显著正相关。

2.3 Hcy与骨密度的关系

2.3.1男性和女性LnHcy与各部位BMD Loess拟合图(图2)

拟合图显示，在Hcy<20μmol/L(LnHcy<3)时，女性各部位BMD均随LnHcy升高缓慢下降，男性随LnHcy升高BMD-H缓慢升高，BMD-L缓慢降低后也升高，然后在Hcy=15μmol/L(LnHcy=2.7)左右时BMD-L、BMD-N和BMD-H 均开始明显下降；Hcy≥20μmol/L时，数据较少，除女性BMD-N显示下降趋势外，其他BMD变化不大。

2.3.2相关分析

总之，教育促进劳动能力的提升同时提高人的思想品德和素质，在21世纪人类进入了以知识作为核心发展的时代，高等教育对于整个社会的发展而言至关重要。因此，全社会都应该更加重视高等教育的发展，特别是政府在这个过程中应发挥主导作用，通过财政拨付等措施发展教育事业，从而加快社会和地区的发展。

Pearson相关分析显示，男性LnHcy与骨密度和25(OH)D均不相关；女性LnHcy仅与BMD-N负相关(r=-0.194，P=0.031)，但多元线性回归校正年龄后，女性LnHcy 与BMD-N不再相关；女性LnHcy与25(OH)D不相关。

2.4 女性骨质疏松性骨折的Logistic回归分析

因男性骨质疏松症患者骨折病例少只收集到1例，故未作分析。

女性骨质疏松症的OPF组(即严重骨质疏松组)与Non-OPF组(Non-Osteoporotic fracture，即单纯骨质疏松组)比较(表7)，只有BMD-N、25(OH)D和年龄组间差异有统计学意义(P=0.005，P=0.010，P=0.012)。

以女性骨质疏松患者是否发生骨折为因变量，以25(OH)D、LnHcy、Ca、P、Mg、ALP、年龄和BMD-L、BMD-N、BMD-H为自变量做Logistic回归，结果(表8)显示血清中25(OH)D每增加1ng/mL骨折风险降低12.4%(OR=0.876，CI 0.782,0.980)，由此推测25(OH)D缺乏可能是中老年女性骨质疏松患者发生骨折的独立危险因素。

表5 男性各部位BMD及相关因素的多元线性回归分析Table 5 Multiple linear regression analysis for BMD at various skeletal sites in males

表6 女性各部位BMD及相关因素的多元线性回归分析Table 6 Multiple linear regression analysis for BMD at various skeletal sites in females

表7 女性骨质疏松患者OPF组与Non-OPF组BMD与生化指标比较Table 7 Comparisons of BMD and plasma biochemical indices between groups of OPF and Non-OPF in females

▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

3 讨论

3.1 维生素D与BMD

维生素D是维持骨骼健康的必需物质[7]，研究证明维生素D缺乏与低骨密度和骨质疏松性骨折相关[13-16]。维生素D促进肠道对钙的吸收，还可通过抑制成骨细胞凋亡，促进骨形成[17]，维生素D缺乏时肠道对钙的吸收减少，低血钙导致继发性甲状旁腺激素(PTH)分泌增加，PTH刺激破骨细胞分化成熟，使骨吸收超过骨形成，引起骨量减少与骨密度下降[18,19]。

25(OH)D是临床评估维生素 D营养状态的最佳指标，目前多数骨质疏松专家组对界定维生素 D营养状态的共识是，25(OH)D≥30 ng/mL为维生素D充足，20 ng/mL≤25(OH)D <30 ng/mL为维生素D不足，10 ng/mL≤25(OH)D<20 ng/mL为维生素 D缺乏,25(OH)D<10 ng/mL为维生素 D严重缺乏。本研究人群25(OH)D平均水平为19.51±7.99 ng/mL，低于20ng/mL，而骨质疏松组更低仅为16.41±6.67 ng/mL。

表8 女性骨质疏松性骨折(OPF)相关因素的Logistic回归分析Table 8 Logistic regression coefficients of osteoporotic fracture in females

图2 男性和女性Hcy和各部位BMD的LOESS拟合图Fig.2 Loess regression plots of BMD by LnHcy in males and females

3.2 维生素D与OPF

跌倒是骨质疏松症患者发生骨折的重要危险因素，研究发现老年人维生素D缺乏可导致骨骼肌功能下降，增加跌倒和骨折的风险[22-24]，联合补充维生素D和钙能有效减少老年人髋部骨折的发生率[15，16]。随着年龄的增长，人体骨骼肌细胞和神经系统细胞中维生素D受体表达降低，如果维生素D缺乏就更易导致肌力下降和中枢神经系统平衡能力降低，增加跌倒的风险。国际骨质疏松基金会(IOF)和欧洲骨质疏松症和骨关节炎临床和经济学会(ESCEO)建议老年人血清25(0H)D水平维持在等于或高于75 mol/L (30ng/mL)水平以降低跌倒和骨折风险[11，25]。本研究大连地区中老年女性骨质疏松性骨折患者25(OH)D水平明显低于无骨折的骨质疏松患者，且骨质疏松性骨折患者100% 存在维生素D不足，其中有32.0%存在维生素D严重缺乏，52%存在维生素D缺乏，与陈浩等[26]对北京146 名年龄60-90 岁老年骨折患者25(OH)D水平分析的结果(维生素D严重缺乏者28.1%，维生素D缺乏者56.8%)相似，提示老年人群维生素D缺乏与骨折的发生具有相关性。妇女健康行动(Women Health Initiative，WHI)显示[27]，血清25(OH)D 水平是老年女性髋部骨折的独立危险因素，血清25(OH) D水平每下降25 nmol/L(10 ng/mL),髋部骨折危险增加1.33倍，血清25(OH)D水平≤47.75 nmol/L(19.1 ng/mL)比≥70.7 nmol/L(28.28 ng/mL)的老年女性髋部骨折危险增加1.71 倍。另外纵向队列研究显示，25(OH)D每降低1个标准差10年内主要部位(髋部、椎骨、桡骨、肱骨)OPF发生风险增加26%-27%[28]，日本老年妇女25(OH)D<20 ng /mL和≥20 ng /mL相比未来5年发生临床骨折、非椎骨骨折和OPF的风险增加(HR分别为1.72、 2.45和 2.00)[29]。本研究也显示维生素D缺乏是大连地区中老年女性骨质疏松症患者发生骨折的重要且独立于年龄和BMD的危险因素，25(OH)D水平每增加1ng/mL骨折发生风险降低12.4%，与以上研究结果一致。

3.3 Hcy和BMD及OPF

Hcy是一种含硫氨基酸，由蛋氨酸代谢产生,受遗传、年龄、维生素B12、叶酸、维生素B6等多种因素的影响，临床主要用于心脑血管疾病的风险预测。近年一些研究发现高Hcy与低骨密度具有相关性[30],伴随着血清HCY浓度升高，骨折相对危险也增加[8-10]。一些基础研究也显示高Hcy可能通过抑制胶原纤维之间的交联，阻碍骨胶原网络结构的形成从而影响骨基质降低骨质量[31,32]，轻中度增高的Hcy可通过生成骨髓细胞内活性氧(ROS)刺激破骨细胞的形成和增加活性，促进骨吸收[33]，增加骨桥蛋白和减弱骨钙蛋白的表达干扰成骨细胞功能[34]，最终使骨形成减少骨密度降低导致骨质疏松。因此一些学者推测血清Hcy水平升高可能是老年人骨质疏松性骨折的危险因素，但实际关于Hcy与BMD及骨折的研究结果并不一致。

荷兰一项关于55岁以上中老年人的研究发现，调整年龄和性别后Hcy与骨密度不相关，校正年龄、性别、体质数等因素后， Hcy的自然对数增加1个标准差骨折的相对危险(RR)为1.4，没有明显性别差异，因此认为血浆Hcy浓度升高可能是老年男性和女性独立于BMD的骨质疏松性骨折强而独立的危险因素[8]。而意大利一项702人(65-94岁)的研究发现，预测未来4年发生骨折事件的风险因子是叶酸而不是Hcy[35]。挪威一项随访12.6年的前瞻性研究表明，65-67岁老年人中高Hcy是髋部骨折的预测因子，叶酸仅在女性中与骨折风险存在负相关[10]。荷兰的另一项研究显示，高Hcy与OPF相关,但股骨颈骨密度的独立影响因素不是Hcy而是叶酸[9]。最近的研究显示美国50岁以上女性Hcy升高与患腰椎骨质疏松(低BMD)的风险增加相关[36]，对上海65岁以上OPF及高能量骨折和非骨折老年人的分析显示血清Hcy水平与腰椎BMD和髋部BMD都不相关[37]。本研究显示大连地区中老年女性骨质疏松症患者骨折组血清Hcy水平高于非骨折组但无统计学意义， Hcy水平并不是女性骨质疏松症患者发生骨折的危险因素，这与多数研究结论不一致。本研究中老年男性lnHcy与各部位BMD均不相关，与黄海燕等[38]对老年男性研究结果一致；而中老年女性BMD与血清Hcy可能有一定相关性。表现为女性骨质疏松组LnHcy高于骨量减低组和骨量正常组且差异有统计学意义，另外校正年龄后女性LnHcy与BMD-N的相关性消失。由于BMD降低与Hcy升高均与增龄有关，故推测女性LnHcy与BMD-N这种相关可能与增龄有关。相似的结果出现在瑞典的一项关于996名女性(75岁以上)7年的研究中，结果高Hcy水平与骨折无明显相关，Hcy水平四分位最高组与其他组比较有更低股骨颈骨密度和大转子骨密度，与腰椎 (L2-L4)骨密度不相关，调整PTH、吸烟和近期骨折等因素后高Hcy水平与低股骨颈骨密度不相关[39]。这与本研究结果相似，均显示老年女性高Hcy水平与低股骨颈骨密度呈现非独立相关，与腰椎骨密度不相关，与OPF不相关。

中老年人群骨质疏松症和维生素D缺乏发生率高，危害大，本研究中大连地区中老年人37.1%患骨质疏松症，55.7%存在维生素D缺乏，骨质疏松症患者中维生素D缺乏更是高达65.4%，因此应定期正确监测血清25(OH)D，并与Hcy、Ca、P、Mg及ALP同时测定，即可提高对骨质疏松症高危人群的识别率，又可及时合理补充维生素D和骨矿化必需元素，这对预防骨丢失和骨质疏松性骨折有重要临床意义。