GeneXpert MTB/RIF 检测在肺结核诊断中的价值评估

牛海军 王歌 李明虎



·论著·

GeneXpert MTB/RIF 检测在肺结核诊断中的价值评估

牛海军 王歌 李明虎

目的 评估GeneXpert MTB/RIF检测方法对结核分枝杆菌(MTB)及其利福平耐药性检测的准确性和可行性。方法 于2012年11月至2015年11月，收集来自河南省南阳市第六人民医院和辖区11个县(区)结核病防治机构的1154例疑似肺结核患者的痰标本。患者痰标本均于河南省南阳市第六人民医院分别进行涂片镜检、固体培养、比例法药敏试验和GeneXpert MTB/RIF检测，分析比较GeneXpert MTB/RIF方法与传统方法检测MTB及利福平耐药性的检测效能。结果 以固体培养结果为金标准，GeneXpert MTB/RIF方法检测MTB的敏感度和特异度分别为90.0% (522/580)和89.5% (418/467)；以传统比例法药敏试验结果为金标准，GeneXpert MTB/RIF方法检测MTB利福平耐药的敏感度和特异度分别为87.7% (64/73)和96.6% (460/476)。结论 GeneXpert MTB/RIF检测MTB有较高的敏感度和特异度，在肺结核快速早期诊断及利福平耐药性检测方面有较好的应用前景。

分枝杆菌，结核； 核酸扩增技术； 利福平； 抗药性

结核病由结核分枝杆菌(MTB)感染引起，仍然是严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。耐药结核病已经成为全球结核病疫情急剧上升的原因之一。一方面，缺乏敏感度高的诊断方法，延误了患者的诊断和治疗；另一方面，作为金标准的MTB培养检查方法耗时较长，滞后于临床诊治需要，导致耐药结核病传播的机会增加。因此，如何快速完成对肺结核特别是涂阴和耐药肺结核的确诊对于结核病的防控具有十分重要的意义。

GeneXpert MTB/RIF检测技术依据荧光定量PCR的原理，针对MTB的rpoB基因81 bp利福平耐药核心区间(RRDR)设计引物、探针，检测其是否发生突变，能直接从患者新鲜痰液里同时检测MTB及其是否对利福平耐药(rpoB序列存在突变)，整个检测时间约为2 h。国内外研究均表明该方法检测的敏感度和特异度都高于现有的检测方法[1-3]，为MTB的检出及其利福平耐药性的检测提供了快速、准确的诊断依据。另外，此项技术整合了传统PCR检测所需的步骤，并将其自动化，使得操作简便，适于临床应用。在结核病高发和耐药形势严峻的地区，对于快速诊断耐药结核病、指导临床合理用药，GeneXpert MTB/RIF检测方法不失为一种有应用价值的检测手段。但该方法在国内应用较晚，目前在县、市级结核病防治机构大规模应用的可行性研究较少。本研究即应用GeneXpert MTB/RIF检测河南省南阳市1154例疑似肺结核患者的痰标本，并与固体培养和传统比例法药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果进行对比，评估其检测效能，为进一步在基层实验室推广该技术提供参考。

资料和方法

1.对象：于2012年11月至2015年11月收集来自河南省南阳市第六人民医院和辖区11个县(区)结核病防治机构的1154例疑似肺结核患者的痰标本。患者痰标本均于河南省南阳市第六人民医院分别进行涂片镜检、固体培养、比例法药敏试验和GeneXpert MTB/RIF检测。

2.方法：(1)痰涂片：参照《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[4]痰萋-尼染色法要求，并按照文献规定的光学显微镜报告标准进行报告。(2)痰培养：参照《结核病诊断实验室检验规程》[5]制备酸性罗氏培养基。采用4%NaOH法对涂片后剩余的标本处理15 min，取0.1 ml无菌操作接种于酸性罗氏培养基斜面，放置于35～37 ℃培养箱中孵育。每周观察结果并及时报告阳性结果，若满8周仍未有菌落生长，则报告培养阴性[5]。(3)比例法药敏试验：用接种环取培养基上的菌落，研磨后与标准麦氏管比对，制成1 mg/ml菌悬液，梯度稀释为10-2mg/ml和10-4mg/ml，接种到含利福平(40 μg/ml)的罗氏固体培养基和空白对照管培养基，37 ℃培养4周后观察结果[5]。(4)rpoB耐药核心区间测序：测序上游引物为5′-CTTGCACGAGGGTCAGACCA-3′；下游引物为5′-ATCTCGTCGCGCTAACCACGCC-3′[6]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(5)GeneXpert MTB/RIF核酸扩增检测：按照GeneXpert MTB/RIF(美国Cephied公司)操作说明书上的步骤，取1 ml痰标本放置到有螺旋盖的前处理管中，然后加入相当于2倍痰标本体积的GeneXpert 样品试剂(SR)，旋紧前处理管，在涡旋振荡器上涡旋振荡15～30 s，室温静置15 min，使痰标本充分液化。打开反应盒，使用试剂盒内提供的专用无菌吸管，取2 ml处理后样品由加样孔缓慢加入反应盒，然后将反应盒放置到检测模块，仪器开始自动化检测。反应结束后，在检测系统窗口下可直接观察测试结果。结果的判断依照探针的循环阈值(Ct值)，当内对照探针Ct值≤38即为阳性，5个探针中至少2个探针Ct值≤38即为检测到MTB。该方法检测利福平耐药的基础在于MTB特异性分子信标早期Ct值和晚期Ct值之差，即ΔCt值，当ΔCt>3.5时提示对利福平耐药，当ΔCt≤3.5时提示对利福平敏感。

3.统计学分析：采用SPSS 13.0软件进行分析，计算GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度和特异度；并对GeneXpert MTB/RIF检测与固体培养法进行一致性检验(Kappa检验)，Kappa值≥0.75认为两者一致性较好。

结 果

1.基本情况：1154例疑似肺结核患者经检测，涂阳401例(34.7%)，涂阴753例(65.3%)；涂阴患者中最后确诊为肺部肿瘤、肺炎、支气管扩张者41例。401例涂阳患者中，20例GeneXpert MTB/RIF检测MTB结果为无效，无效率为5.0%；经实验室查找，涂片阳性级别1+及以下18例，2+级别2例，6例检测结果为无法判断。753例涂阴患者中，73例 GeneXpert MTB/RIF检测MTB结果为无效，8例检测结果为无法判断。最终可进行GeneXpert MTB/RIF对比分析者1047例；其中，痰培养阳性580例，31例GeneXpert MTB/RIF检测利福平耐药结果无法判断，最终可进行对比分析者549例。

2.GeneXpert MTB/RIF对MTB的检测结果：使用GeneXpert MTB/RIF检测1047例疑似肺结核患者，其中，涂阳375例(35.8%)，涂阴672例(64.2%)。以固体培养结果为金标准，GeneXpert MTB/RIF检测涂阳患者MTB的敏感度为97.8%(353/361)，特异度为14.3%(2/14)；检测涂阴患者MTB的敏感度为77.2%(169/219)，特异度为91.8%(416/453)；全部患者检测的敏感度为90.0%(522/580)，特异度为89.5%(418/467)，见表1。在肺部肿瘤、肺炎、支气管扩张的41例非结核患者中，有2例GeneXpert Mtb检测阳性，特异度为95.1%(39/41)。对GeneXpert MTB/RIF和固体培养进行Kappa检验，Kappa值为0.815，两者具有较好的一致性。

表1 GeneXpert MTB/RIF法对痰标本中MTB的检测效能分析(例)

表2 GeneXpert MTB/RIF法对痰标本中MTB利福平耐药情况的检测效能(例)

3.GeneXpert MTB/RIF检测MTB耐药性分析：使用GeneXpert MTB/RIF方法检测培养阳性549例患者痰标本中的MTB对利福平的耐药性，其中涂阳353例(64.3%)，涂阴196例(35.7%)。以比例法药敏结果为金标准，GeneXpert MTB/RIF检测涂阳患者利福平耐药的敏感度为89.1%(49/55),特异度为97.3%(290/298)；检测涂阴患者利福平耐药的敏感度为83.3%(15/18)，特异度为95.5%(170/178)；检测全部患者的敏感度为87.7%(64/73)，特异度为96.6%(460/476)，见表2。对GeneXpert MTB/RIF和比例法药敏试验进行Kappa检验，Kappa值为0.811，两者具有较好的一致性。

讨 论

结核病的早期诊断和耐药性检测对于更好地控制耐药结核病的传播具有十分重要的意义。目前，我国肺结核诊断所依据的实验室检查中，细菌学检查仍是诊断的金标准，主要包括痰涂片和培养2种方法。但是，痰涂片直接镜检法阳性率不高，且受痰标本质量的影响较大；而培养方法检测需要5～8周时间，明显滞后于临床医师对肺结核早期诊断的期望。此外，传统的药敏试验受到许多因素的影响，并且耗时过长。因此，建立和推广特异度、敏感度高的MTB检测和耐药性检测方法至关重要。

GeneXpert MTB/RIF是近年迅速发展的基因诊断技术，与传统检测方法相比，敏感度和特异度均有明显提高。本研究中，GeneXpert MTB/RIF对痰标本MTB检测的敏感度为90.0%，特异度为89.5%；对利福平耐药检测的敏感度为87.7%，特异度为96.6%，与国内文献报道一致[7]。此外，由于大部分(约86%)利福平耐药株同时对异烟肼耐药[8]，故在利福平耐药的情况下，一定程度上可作为耐多药结核病的筛查和监测指标。

GeneXpert MTB/RIF虽然对涂阳培阳的样本阳性检出率较高，但对涂阴培阴的检出率仍不高。本研究中有107例患者的传统固体培养和GeneXpert MTB/RIF检测MTB的结果不一致，经查证，49例培养阴性而GeneXpert MTB/RIF检测MTB结果为阳性患者中，29例为复治肺结核，这主要是由于培养法敏感度低所致，也可能与培养前应用抗结核药物导致标本内MTB生长能力下降或形成死菌有关；401例涂阳患者中，20例GeneXpert MTB/RIF检测MTB结果无效，考虑为阳性级别较低标本中MTB浓度低所致。上述结果均提示该方法的可靠性依赖于样本中的细菌载量，且与正确的样本采集、处理和存储有关。

总之，GeneXpert MTB/RIF具有快速、高效的特点，且只需2 h即可完成，极大地缩短了检测的时间，有助于对患者尽快确诊并及时采取治疗手段。其作为集MTB检测和MTB利福平耐药检测为一体的新型检测技术，检测诊断准确率高，应用价值大；作为安全、快速的临床检查手段，对于肺结核的早期诊断和耐药性检测具有积极意义。因此，在结核病高发和耐药形势严峻的地区，对于快速诊断耐药结核病、指导临床合理用药，GeneXpert MTB/RIF不失为一种有应用价值的检测手段，值得在县、市级结核病防治机构推广应用。

[1] 陈子芳, 孙义军, 孙本海. GeneXpert MTB/RIF系统在肺结核诊断及利福平耐药检测中的应用价值. 中华临床感染病杂志, 2014, 7(4): 351-353.

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(本文编辑：李敬文)

Assessment of GeneXpert MTB/RIF test for diagnosis of pulmonary tuberculosis

NIUHai-jun，WANGGe,LIMing-hu.

NanyangTuberculosisControlInstitute，Nanyang473001，China

NIUHai-jun，Email：154573539@qq.com

Objective To evaluate the accuracy and feasibility of GeneXpert MTB/RIF test in detectingMycobacteriumtuberculosis(MTB) and rifampin resistance. Methods From November 2012 to November 2015, the sputum samples of 1154 suspected cases from Nanyang Sixth People’s Hospital and tuberculosis control institutions in 11 counties (districts) in Nanyang city, Henan province, were collected. The smear microscopy, solid culture, traditional proportion method of drug susceptibility test and GeneXpert Mtb/RIF test were conducted in Nanyang Sixth People’s Hospital. This study aimed to compare the GeneXpert MTB/RIF method and traditional method to detect MTB and rifampicin resistance. Results Considering the solid culture method as gold standard, the sensitivity and specificity of GeneXpert MTB/RIF test in detecting MTB were 90% (522/580) and 89.5% (418/467), respectively. Considering the traditional proportion method as gold standard, the sensitivity and specificity of GeneXpert MTB/RIF test in detecting rifampin resistance were 87.7% (64/73) and 96.6% (460/476), respectively. Conclusion GeneXpert MTB/RIF detects MTB with high sensitivity and specificity, and has good prospects in early diagnosis of tuberculosis and detection of rifampicin resistance.

Mycobacteriumtuberculosis; Nucleic acid amplification techniques; Rifampin; Drug resistance

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.008

473001 河南省南阳市结核病防治所

牛海军，Email：154573539@qq.com

2017-05-15)