马铃薯块茎蛾肠道细菌分离鉴定及其对植物源大分子化合物的降解作用

郑亚强，杜广祖，李亦菲，陈 斌*，李正跃，肖关丽

马铃薯块茎蛾肠道细菌分离鉴定及其对植物源大分子化合物的降解作用

郑亚强1，杜广祖1，李亦菲1，陈 斌1*，李正跃1，肖关丽2*

(1.云南农业大学植物保护学院，昆明 650201；2.云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201)

为弄清马铃薯块茎蛾肠道可培养细菌的群落结构及其功能。本研究采用牛肉膏蛋白胨培养基，对马铃薯块茎蛾4龄幼虫肠道细菌进行了分离培养，采用16S rDNA序列对各菌株进行种属鉴定，并采用酶鉴定培养基法测定了肠道各细菌对淀粉、纤维素、木聚糖和果胶等植物源大分子物质的降解作用。从马铃薯块茎蛾肠道内共分离到细菌8属10种，分别为不动杆菌属Acinetobacte、葡萄球菌属Staphylococcus、肠杆菌属Enterobacter、节细菌属Arthrobacter、鞘氨醇杆菌属Sphingobacterium、寡养单胞菌属Stenotrophomonas、束村氏菌属Tsukamurella和克雷白氏杆菌属Klebsiella。其中仅鞘氨醇杆菌属菌株LZD10、阿氏节杆菌属菌株LZN13、烟草节杆菌属菌株HZN9对淀粉具有明显的降解作用，但对纤维素、木聚糖和果胶无降解作用，而其余菌株对4种化合物均无降解作用。该研究结果将为深入研究马铃薯块茎蛾对马铃薯块茎的食物适应机制及防治提供理论依据。

马铃薯块茎蛾；肠道细菌；降解作用

马铃薯块茎蛾Phthorimaeaoperculella(Zeller)又名烟草潜叶蛾，隶属于鳞翅目双孔亚目麦蛾总科麦蛾科茎麦蛾属(李后魂，2002)。该虫目前已分布至亚洲、欧洲、北美洲、非洲、大洋洲、中美及南美洲，分布范围较广，该虫能取食烟草、马铃薯、茄子、曼陀罗和龙葵等茄科作物和杂草。但是喜食烟草、马铃薯、茄子，其中马铃薯在大田种植期和储存期皆能被其危害(Rondon and Xue，2010)。其分布范围之广，繁殖力之快，给防治带来了巨大的困难。

昆虫肠道微生物被认为是昆虫的第二套遗传密码(Zilber and Rosenberg，2008)，其参与昆虫机体许多重要的生理生化反应，如帮助昆虫消化大分子物质(Warneckeetal.，2007；Lundgren and Lehman，2010)、合成昆虫所需的营养物质(Hansenetal.，2011 ；Salemetal，2014)、介导昆虫抗药性(Mansourietal.，2013)、影响昆虫的交配行为(Sharonetal.，2010)、寄主选择性(McLeanetal.，2011)和对环境的适应性(Tsuchidaetal.，2010)等生理作用。而基于昆虫共生微生物和昆虫的共生关系而发展起来的共生防治(Dillon and Dillon，2004)，将为害虫综合防治提供新途径，因此弄清肠道微生物种类和功能显得尤其重要。然而，对于马铃薯块茎蛾肠道微生物的多样性和功能还知之甚少，仅Sevim等(2015)直接将马铃薯块茎蛾幼虫体研磨成菌悬液，从中分离得到8个菌株，但是这些菌株具体的生理功能并不清楚。本研究基于微生物分离培养技术，对马铃薯块茎蛾肠道细菌进行分离培养及形态与分子鉴定，测定了这些菌株对大分子物质的降解能力，拟揭示马铃薯块茎蛾肠道细菌群落结构和研究马铃薯块茎蛾肠道细菌功能提供可培养菌株。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试马铃薯块茎蛾采集于云南省宣威市板桥镇马铃薯种植区，海拔1967 m，N26°05′52.3″，E104°04′27.5″，室内采用马铃薯块茎饲养3代。

1.2 主要试剂

果胶(Sigma公司)，可溶性淀粉(天津市风船化学试剂科技有限公司)，纤维素(Sigma公司)，木聚糖(Sigma公司)，琼脂糖(基因科技(上海)有限公司)，100 bp DNA ladder和2×Taq PCR Mastermix(北京全式金生物技术有限公司)，Goldview核酸染料(上海赛百盛基因技术有限公司)，引物Prime1：27F-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG，Prime2：1492R-CGGTTACCTTGTTACGA CTT(由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成)，溶菌酶，蛋白酶K，酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)，1×TE配制方法参照萨姆布鲁克等(2002)的方法。

1.3 肠道细菌分离及形态鉴定

选取大小一致、健康的马铃薯块茎蛾4龄幼虫，饥饿处理24 h，取50头于-20 ℃下冻3 min，于无菌水中清洗1 min，再放于75%乙醇消毒3 min，最后放于无菌水中清洗，用镊子从虫体尾部取出肠道，放于1.5 mL离心管中，加少量生理盐水，匀浆，补充水量至1 mL。将上述制备好的悬浮液，分别稀释到10-5、10-6和10-7梯度，然后用移液枪移取100 μL菌悬浮液涂于牛肉膏蛋白胨培养基(黄秀梨和辛明秀，2008)，30℃培养24-48 h后，根据菌落形态，挑取形态各异的单菌落到新培养基上划线纯化2-3次，斜面培养基培养后于4℃保存。

采用革兰氏染色法对细菌进行染色，显微镜下观察其细胞形态及其革兰氏阴阳性。

1.4 细菌分子鉴定及系统发育分析

采用冻溶法提取细菌DNA(冯广达等，2013)，具体操作如下，将菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，然后放置于30 ℃、150 r/min的摇床(上海知楚仪器有限公司，ZQLY-180F)，振荡培养48 h。每个菌株分别取2 mL菌液于离心管中，12000 r/min 离心2 min，弃上清液。在上述沉淀中加入500 μL无菌蒸馏水，涡旋1 min，使其菌体完全悬浮于水中。置于液氮冰冻10 min，沸水中水浴 5min，12000 r/min离心2 min，上清液即可作为PCR模板备用。

运用细菌通用引物27 f和1492 r 扩增16S rRNA基因，反应体系为25 μL：引物各1 μL，模板 DNA 1 μL，PCR mi×12.5 μL，dd H2O 9.5 μL。反应条件：94 ℃热变性5 min；94 ℃变性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸2 min，32个循环，72℃延伸10 min。取3 μL PCR产物凝胶电泳检测。鉴定好的PCR产物送昆明硕擎生物技术有限公司测序。

运用Contigexpress软件对测序结果进行拼接，将拼接好的16S rDNA序列，提交到NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找相似性最高的典型菌株并下载序列，运用MEGA 6.06 软件，采用国际通用的邻接法(Neighbour-Joining)和Kimura双参数矫正模型构建系统发育树。以重复抽样1000次进行Bootstrap 验证，分析评估系统进化树的拓扑结构的稳定性。

1.5 可培养菌株对大分子物质的降解能力的测定

采用透明圈法测定可培养细菌对淀粉、果胶、纤维素、木聚糖4种大分子物质的降解能力。淀粉降解能力测定，具体参照黄秀梨和辛明秀(2008)的方法；纤维素降解能力，果胶降解能力和木聚糖降解能力参照夏晓峰(2014)。

2 结果与分析

2.1 细菌分离及形态结果

本试验从马铃薯块茎蛾4龄幼虫肠道中(包括前肠，中肠和后肠)，分离得到菌落形态各异的14个菌株。其菌落形态有圆形，有规则性，有不规则性，颜色有淡黄色，乳白色，半透明透明，其菌落具体形态详见表1。通过革兰氏染色发现阳性菌11株，3株为革兰氏阴性。菌株细胞形态为6株球形，8株杆状。

表1 马铃薯块茎蛾4龄幼虫肠道细菌的菌落形态及培养性状Table 1 Colonial morphology and cultural characteristics of bacteria from gut of the 4th instar larvae of Phthorimaea operculella(Zeller)

2.2 细菌分子鉴定及系统发育分析

通过16S rDNA序列比对，发现在分离培养的14株细菌中，分别属于4门7科8属10种，其中有6株菌株分别属于变形菌门Proteobacteria莫拉氏菌科Moraxellaceae的不动杆菌属Acinetobacter、黄单胞菌科Xanthomonadaceae的寡养单胞菌属Stenotrophomonas、肠杆菌科Enterobacteriaceae的克雷伯氏杆菌属Klebsiella和Morganellaceae科的变形杆菌属Proteus；4株菌株属于厚壁菌门Firmicutes葡萄球菌科Staphylococcaceae的葡萄球菌属Staphylococcus；1株属于Bacteroidetes拟杆菌门的鞘脂杆菌科Sphingobacteriaceae的鞘氨醇杆菌属Sphingobacterium；3株属于放线菌门微球菌科Micrococcaceae的Glutamicibacter菌属和束村氏菌科Tsukamurellaceae的束村氏菌属Tsukamurella。

表2 分离菌株与数据库典型菌株的比对结果Table 2 The results of bacteria strains from the 4th instar larvae gut of Phthorimaea operculella(Zeller)between the database of typical strains

在种水平上，菌株HZD10、LZN8、LZN14与琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii strain ATCC 17908)的相似性为99%。菌株HZN10、LZN6与松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuristrain DSM 20345)的相似性分别为99%和98%。菌株LZN2、LZN10与腐生葡萄球菌(StaphylococcussaprophyticusstrainRGN1.1)相似性为99%。菌株HZN8与普通变形杆菌(Proteusvulgarisstrain ATCC 29905)的相似性为99%。菌株HZN9与烟草节杆菌(Arthrobacternicotianaestrain DSM 20123)的相似性为99%。LZN13与阿氏节杆菌(Arthrobacterarilaitensis)RE117相似性为100%。菌株LZD10与Sphingobacteriumginsenosidimutansstrain THG 07的相似性为99%。菌株LZD5与嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophiliastrain ATCC 13637)的相似性为99%。菌株LZD6与耐酪氨酸冢村氏菌(Tsukamurellatyrosinosolvensstrain DSM 44234)的相似性为100%。LZN7与产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytocastrain JCM1665)的相似性为99%。

从系统发育树(图1)可以看出，系统树分为3大支6小支。其中一大支由变形菌门的菌株组成，隶属肠杆菌目的变形杆菌属的菌株HZN8与其他已公布的变形杆菌属的菌株首先聚为一支，后与克雷伯氏杆菌属的菌LZN7聚为一小支，说明两者之间亲缘关系较近。不动杆菌属的菌株LZN8、HZD10和 LZN14与不动杆菌属的已知的其他菌株单独聚为一小支。寡养单胞菌属的菌株LZD5与寡养单胞菌属的已知的其他菌株也单独聚为一小支，这三小分支构成了变形菌门这一大支；在系统树中的另一大支由厚壁菌门和放线菌门的菌株组成，首先厚壁菌门葡萄球菌属的菌株HZN10、LZN6与已公布的松鼠葡萄球菌菌株具为一小支，然而与LZN2、LZN10以及腐生葡萄球菌其他已公布的菌株聚为一支，再与放线菌门Glutamicibacter菌属的菌株HZN9和LZN13以及束村氏菌属的菌株LZD6聚为一大支；而拟杆菌门鞘氨醇杆菌属的菌株LZD10与鞘氨醇杆菌属的其他已公布的菌株单独聚为一大支。

2.3 对大分子物质的降解作用结果

采用透明圈法测定分离至马铃薯块茎蛾肠道内的不动杆菌属、葡萄球菌属、肠杆菌属、节细菌属、鞘氨醇杆菌属、寡养单胞菌属、束村氏菌属和克雷白氏杆菌属菌株对淀粉、纤维素、木聚糖和果胶的降解作用，结果表明，只有鞘氨醇杆菌属菌株LZD10、阿氏节杆菌属菌株LZN13、烟草节杆菌属菌株HZN9对淀粉具有明显的降解作用，但对纤维素、木聚糖和果胶无明显的降解作用，其余菌株对4种大分子物质均无降解作用。

3 结论与讨论

本研究发现，从马铃薯块茎蛾肠道分离得到的14个菌株分别属于变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidetes和放线菌门Actinobacteria，其中6株属于变形菌门，4株属于厚壁菌门，表明变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes是马铃薯块茎蛾肠道细菌的优势门。该结果与其他昆虫肠道细菌优势类群结果相似(Colmanetal.，2012；Yunetal.，2014)。因此，变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes可能是昆虫长期协同进化的结果。此外，Sevim等(2015)将马铃薯块茎蛾整头幼虫研磨制备成菌悬浮液，运用营养琼脂培养基分离得到7属8个菌株分别是芽孢杆菌属Bacillussp.、松鼠葡萄球菌Staphylococcussciuri、蒙氏肠球菌Enterococcusmundtii、酪黄肠球菌E.casseliflavus、粪产碱杆菌Alcaligenesfaecalis、肠杆菌属Enterobactersp.、成团泛菌Pantoeaagglomerans和荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens。而本研究分离到8属10个种的菌株，在属水平上，肠杆菌属和葡萄球菌属与Sevim的分离结果相同，而其他菌株则均不相同。造成这种差异可能与马铃薯块茎蛾虫源，分离所用的组织部位和所用培养基不一样所致。在种水平上，仅葡萄球菌属的松鼠葡萄球菌与Sevim等人分离结果相同，Leroy等人(2011)研究发现，从豌豆长管蚜蜜露中分离到的松鼠葡萄球菌能分泌化学信息素，吸引昆虫天敌。但对于马铃薯块茎蛾肠道中含有的松鼠葡萄球菌，是否具有吸引天敌的作用，值得进一步研究和探索。

不同种类昆虫体内细菌，其具有不同的生理功能，如葡萄球菌属能产生化学信息素吸引昆虫天敌、调控昆虫的免疫信号通路(Douglas，2015)；不动杆菌属的菌株具有氮素转化功能(Nalcacietal.，2011)；肠杆菌属Enterobacter能介导昆虫对B.thuringiensis的敏感性(Brodericketal.，2006)和帮助昆虫降解碳水化合物(Potrikus and Breznak， 1977；Anandetal.，2010；Xiaetal.，2013)；克雷白氏杆菌属Klebsiella的菌能产生昆虫聚集信息素(Engel and Moran，2013)；寡养单胞菌能产生淀粉酶(罗立华等，2016)；而对于马铃薯块茎蛾肠道中的这些细菌是否同样具有这些生理功能，还有待得进一步研究。尤其是对于束村氏菌属、鞘氨醇杆菌属和节杆菌属细菌，其对昆虫的生理功能还不见报道，而本研究发现这三个属细菌存在于马铃薯块茎蛾肠道中，因此对于这三个属细菌对马铃薯块茎蛾的生理功能亦值得进一步探索。

图1 基于16S rDNA的序列的系统发育树分析Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

本研究发现，从马铃薯块茎蛾肠道中分离获得的鞘氨醇杆菌属菌LZD10、烟草节杆菌属菌株HZN9和阿氏节杆菌菌属菌株LZN13具有降解淀粉的功能，该降解淀粉的功能还未在昆虫肠道微生物中有报道还未见报道。因此，鞘氨醇杆菌属、烟草节杆菌属和阿氏节杆菌菌属可能是马铃薯块茎蛾为适应高淀粉食物而形成的特有菌属，也是马铃薯块茎蛾在高含量淀粉马铃薯块茎上生长发育和繁殖能力较好的重要原因。

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Isolation and identification of bacteria from larval gut of the potato tuberworm,Phthorimaeaoperculella(Zeller) and the degradation for plant-based macromolecular compounds

ZHENG Ya-Qiang1, DU Guang-Zu1, LI Yi-Fei1, CHEN Bin1, LI Zheng-Yue1, XIAO Guang-Li2*

(1.College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2.College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201,China)

In order to study the cultural bacteria community structure in the larval gut of potato tuber moth, and its relationship with the feeding characteristics.The bacteria in the 4thinstar larve gut of the potato tuber moth was isolated on the beef peptone medium, bacteria were identified using the 16S rDNA sequence, the biodegradation activity for plant based macromolecular compounds including amylum, fibre, xylan and pectin was evaluated using the enzyme assay culture techniques.The results showed that ten species of bacteria belonging to seven genera were isolated form the gut of the 4thinstar larvae ofPhthorimaeaoperculella(Zeller), those bacteria wereAcinetobacte,Staphylococcus,Enterobacter,Arthrobacter,Sphingobacterium,Klebsiella,TsukamurellaandStenotrophomonas.TheSphingobacteriumstrain LZD10,Staphylococcusstrain LZN13 andArthrobacterstrain HZN9 can degrading the amylum, but the macromolecular of cellulose, xylan and pectin can’t be degraded by those gut bacteria.Other 7 strains can’t degrade the amylum, fibre, xylan and pectin.The study showed that there were the amylum degrading bacteria in the 4thinstar larval gut of the potato tuber moth, this study will provide a theoretical base for the further study on feeding potato tuber feeing mechanisms of potato tuber moth.

Phthorimaeaoperculella(Zeller); gut bacteria; degradation effect

郑亚强，杜广祖，李亦菲,等.马铃薯块茎蛾肠道细菌分离鉴定及其对植物源大分子化合物的降解作用[J].环境昆虫学报，2017,39(3):525-532.

云南省教育厅科学研究基金重大专项(ZD2015006); 云南省政府特色农业产业专项 (云财农[2013]364号)；国家自然科学基金项目(31660537)；云南省烟草公司科技计划项目(2015YN24)资助；2015年地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目(201510676008)

郑亚强，男，1987年生，贵州遵义人，博士研究生，研究方向为昆虫肠道微生物多样性及其功能，E-mail：736364746@qq.com

*通讯作者Author for correspondence： E-mail: chbins@163.com；E-mail: glxiao9@163.com

Received: 2017-01-05; 接受日期Accepted: 2017-05-08

Q968.1

A

1674-0858(2017)03-0525-08