绿原酸抑制HepG2细胞增殖的体外研究

闫 媛,李 杰,侯 妮,董 蕾

(1西安市中心医院消化科,西安 710003;2西安交通大学第二附属医院普外科;3西安交通大学医学院遗传学与分子生物学研究室;4西安交通大学第二附属医院消化科;*通讯作者,E-mail:lijie.0532@hotmail.com)



绿原酸抑制HepG2细胞增殖的体外研究

闫 媛1,李 杰2*,侯 妮3,董 蕾4

(1西安市中心医院消化科,西安 710003;2西安交通大学第二附属医院普外科;3西安交通大学医学院遗传学与分子生物学研究室;4西安交通大学第二附属医院消化科;*通讯作者,E-mail:lijie.0532@hotmail.com)

目的 研究不同浓度绿原酸对肝癌细胞的抑制作用,以及对肝癌细胞MAPK/ERK信号通路的影响。 方法 分别应用50,125,250,500,1 000 μmol/L绿原酸与肝癌细胞株HepG2细胞共孵育24 h,Trypan blue染色并进行HepG2细胞计数,Western blotting测定HepG2细胞MAPK/ERK信号通路的ERK1/2磷酸化,CM-H2DCFDA荧光探针测定HepG2细胞内ROS浓度,观察绿原酸对HepG2细胞增殖的抑制作用。 结果 与0 μmol/L组比较,500,1 000 μmol/L组HepG2细胞的增殖分别降低了45.5和81.7个百分点;绿原酸抑制HepG2细胞MAPK/ERK信号通路的ERK1/2磷酸化(P<0.01);绿原酸促进HepG2细胞内ROS浓度升高。 结论 绿原酸通过抑制MAPK/ERK信号通路的活化遏制肝癌细胞增殖。

绿原酸; MAPK/ERK信号通路; HepG2细胞

肝细胞肝癌是肝脏的恶性肿瘤,致死亡率高达93%[1,2],为全球第三位。原发性肝癌的主要致病因素是慢性乙型病毒性肝炎和慢性丙型病毒性肝炎[3],黄曲霉毒素、酒精和导致肝损伤的毒性化合物等也是肝癌的高危致病因子;近年来随着非酒精性脂肪肝发病率的增高,其所引起的原发性肝癌发生比例也在同步增加。虽然肝癌的的诊断和治疗在不断地探索和研究过程中有一定的进展,但肝癌仍是一种高致死率的疾病。目前针对肝癌的治疗方法主要为手术切除、肝移植、肝动脉灌注化疗栓塞、分子靶向治疗等。但是上述治疗方法对患者生存期改善有限,治疗后极易再出现病灶复发及转移。如何抑制肝细胞癌变,降低慢性肝病进展为肝癌的发生率,越来越受到国内外学者的关注。

近年来,流行病学研究发现咖啡的消耗与肝癌的发病存在负相关,感染HBV患者的长期坚持饮用咖啡,可有效降低肝癌的发生率[4]。长期坚持饮用咖啡的HCV肝炎患者肝癌发生率较未饮用咖啡的慢性HCV肝炎患者的肝癌发生率显著降低[5]。日本厚生劳动省一项调查显示,喝咖啡组的肝癌发病率仅为不喝咖啡组的25%,喝咖啡可降低肝癌发病率[6]。绿原酸(chlorogenic acid,CGA)作为一种广泛存在于自然界的多酚类化合物,主要来源于咖啡,具有广泛的生物活性,具备抗氧化、抗炎症作用、抗细菌、抗病毒及调节血脂等多种生物性作用。本研究应用人肝癌细胞株HepG2细胞,观察绿原酸对肝癌细胞的抑制作用及作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要试剂

HepG2细胞购自美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC),绿原酸购自美国Sigma-aldrich公司,CM-H2DCFDA荧光探针购自美国Invitrogen公司,ERK抗体、磷酸化ERK抗体、β-actin抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞培养及分组

使用10%胎牛血清、高糖DMEM培养基,置于37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养HepG2细胞,隔天换液,1 ∶4传代,选择中位线生长HepG2细胞进行实验。消化制备单细胞悬液,进行细胞计数,以细胞浓度为2×105个/孔(每孔2 ml)接种于6孔板,设空白对照组及CGA干预组,其浓度分别为50,125,250,500,1 000 μmol/L,并设两组复孔,37 ℃,5% CO2和饱和湿度条件下培养24 h。

1.3 Trypan blue染色计数HepG2细胞

弃培养基,PBS洗涤,胰酶消化收集细胞液,1 200 r/min离心5 min,弃去上清液,沉淀物加入200 μl PBS 轻柔吹打均匀成细胞液,取40 μl 细胞液加入20 μl 0.4% Trypan blue吹打均匀后于光学显微镜下计数未染色HepG2细胞(活性细胞)及蓝色HepG2细胞(无活性细胞)。

1.4 CM-H2DCFDA荧光探针测定细胞内ROS

各组HepG2细胞800 μl PBS洗涤后,分别加入CM-H2DCFDA荧光探针(5 μmol/L),置入37 ℃,5%CO2培养箱5 min,PBS洗涤3次后于荧光显微镜观察HepG2细胞内ROS浓度,以上操作在暗室进行。

1.5 Western blotting测定磷酸化ERK1/2表达

各组HepG2细胞加入细胞裂解液,收集裂解后HepG2细胞移入离心管,冰上1 h(每间隔10 min震荡),4 ℃,14 000 r/min离心10 min,弃去沉淀,保留上清液。BCA法测定蛋白浓度,加入Loading buffer,Lysis,100 ℃煮沸5 min,分别制成20 mg/ml的蛋白样品,经SDS-PAGE电泳及转膜后,加入ERK(1 ∶1 000),磷酸化ERK(1 ∶1 000),β-actin(1 ∶2 000),4 ℃孵育过夜,用PBST充分洗膜后,加入二抗孵育液(1 ∶5 000)室温孵育2 h,发光液浸膜5 min,化学发光法显色,可见发光条带,Quantity One(BIO-RAD)软件进行图像分析。

1.6 统计学分析

所有数据均采用SPSS18.0统计软件进行分析处理,各组构成率比较应用Pearson χ2检验并进行相关性分析。计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CGA抑制肝癌细胞增殖

不同浓度CGA作用后,各组活性HepG2细胞与对照组总细胞对比,低浓度CGA 对活性HepG2细胞比例无影响,500 μmol/L CGA时活性HepG2细胞比例下降45.5个百分点(P<0.05),1 000 μmol/L CGA时活性HepG2细胞比例下降81.7个百分点(P<0.01，见图1),当浓度>250 μmol/L时，CGA对HepG2细胞的抑制与浓度呈正相关。

与对照组(0 μmol/L)相比,*P<0.05,**P<0.01图1 不同浓度CGA作用24 h HepG2细胞的存活率Figure 1 Viability of HepG2cells treated by different conccentration of CGA for 24 h

不同浓度CGA作用后,各组活性HepG2细胞与组内总细胞对比,各浓度组间无统计学差异(P>0.05,图2)。

2.2 CGA抑制肝癌细胞MAPK/ERK信号通路的ERK磷酸化

50,125,250 μmol/L CGA对HepG2细胞的ERK磷酸化无明显影响。500,1 000 μmol/L CGA 对HepG2细胞MAPK/ERK信号通路的ERK磷酸化呈现抑制作用,差异具有统计学意义(P<0.01,见图3)。

图2 不同浓度CGA作用24 h组内HepG2细胞的存活率Figure 2 Viability of HepG2cells intra-group treated by different conccentration of CGA for 24 h

2.3 CGA影响肝癌细胞内ROS浓度

随CGA浓度增加,ROS稍增强,500 μmol/L、1 000 μmol/L CGA 时HepG2细胞内ROS显著增加(见图4)。

A.空白对照组;B.50 μmol/L CGA; C.125 μmol/L CGA; D.250 μmol/L CGA;E.500 μmol/L CGA;F.1 000 μmol/L CGA图4 不同浓度CGA作用HepG2细胞内ROS荧光强度(×200)Figure 4 Fluorescence intensity of ROS in HepG2cells treated with different concentrations of CGA(×200)

3 讨论

Ziech等[7]指出自然界存在的一些天然植物素对恶性肿瘤的发生有化学预防作用,本研究显示绿原酸作为一种天然多酚类化合物,对HepG2细胞的增殖有抑制作用,其抑制作用与剂量呈相关性,低浓度绿原酸对HepG2细胞无明显影响,但随着浓度升高,绿原酸对HepG2细胞呈现抑制作用,500 μmol/L绿原酸使活性HepG2细胞减少45.5个百分点,1 000 μmol/L绿原酸使活性HepG2细胞减少81.7百分点(见图1)。但绿原酸各浓度组间活性HepG2细胞差异无统计学意义(见图2)。因此,绿原酸抑制HepG2细胞的增殖,并且绿原酸对HepG2细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性。

ROS作为一种细胞内的重要信号分子,参与细胞内多条信号通路的传导,涉及细胞的酶代谢、基因表达、炎症反应等多种重要生理过程[8]。本研究通过应用CM-H2DCFDA荧光探针发现绿原酸影响HepG2细胞内的ROS浓度。国外研究发现ROS是MAPK/ERK信号通路的上游信号分子[9,10],细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)调节转录因子活性,是传递丝裂原信号的信号转导蛋白。ERK信号途径在肿瘤侵袭和转移过程调控基因表达,参与细胞生长、分化,并且在细胞恶变的演进过程起非常重要的作用。朱虹等[11]发现ERK在肝癌细胞表现为过度激活,赵雅娟等[12]发现ERK-1和Cyclin D1在肝癌中的表达显著高于癌旁组织和正常组织。崔海鹏等[13]研究显示肝癌发生过程中Ras激活MAPK/ERK和NF-κB通路促进Cyclin D1表达。有研究发现丙肝肝炎病毒E1蛋白可以促进肝癌细胞株SMMC-7721的MAPK/ERK信号通路活化从而促进肝癌细胞的增殖,ERK在肝癌的增殖过程起至关重要的作用[14,15]。因此,MAPK/ERK信号通路异常活化是肝癌发生发展的一个非常重要的发病机制。本研究通过Trypan blue染色观察到绿原酸抑制肝癌细胞增殖,进一步实验发现肝癌细胞内同步ROS浓度升高及ERK磷酸化抑制。由此可见绿原酸通过ROS的介导抑制肝癌细胞异常活化MAPK/ERK信号通路的ERK磷酸化进而来抑制肝癌的增殖。

综上所述,本研究显示绿原酸通过抑制肝癌细胞异常活化的MAPK/ERK信号通路活性来抑制肝癌细胞的增殖,进而遏制肝癌的生长,这为肝细胞肝癌的治疗提供了新的治疗靶点,因此,绿原酸作为一种天然酚类化合物可能被应用于治疗肝癌。

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Vitro study of chlorogenic acid inhibiting proliferation of HepG2cells

YAN Yuan1,LI Jie2*,HOU Ni3,DONG Lei4

(1DepartmentofGastroenterology,Xi’anCentralHospital,Xi’an710003,China;2DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;3DepartmentofGeneticsandMolecularBiology,MedicineSchoolofXi’anJiaotongUniversity;4DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:lijie.0532@hotmail.com)

ObjectiveTo investigate the effect of chlorogenic acid(CGA) on hepatocarcinoma cells and MAPK/ERK pathway.MethodsHepG2cells were co-incubated with 50,125,250,500,1 000 μmol/L CGA for 24 h respectively.HepG2cells were counted after Trypan blue staining.ERK1/2 phosphorylation of MAPK/ERK pathway was detected by Western blotting.Intracellular concentration of reactive oxygen species(ROS) was detected using fluorescent probes after treatment with CGA.ResultsCompared with blank group,the proliferation of HepG2cells increased by 45.5 and 81.7 percentages in 500,1 000 μmol/L CGA group.The 500,1 000 μmol/L CGA inhibited ERK1/2 phosphorylation(P<0.01).Fluorescent probes results showed that CGA promoted ROS regeneration in HepG2cells.ConclusionCGA may inhibit the proliferation of hepatocarcinoma cells through preventing the activation of MAPK/ERK pathway.

chlorogenic acid; MAPK/ERK pathway; HepG2cells

闫媛,女,1973-09生,博士,副主任医师,E-mail:yanyuancn@hotmail.com

2017-02-16

R735.7

A

1007-6611(2017)06-0515-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.001