黄刺玫果实醇提物抗血栓作用及其机制研究

任 婧,王进东,*,柴秋彦,杨官娥,卫 罡

(1山西医科大学药学院中药学教研室,太原 030001;2山西省医药与生命科学研究院;*通讯作者,E-mail:844381238@qq.com)



黄刺玫果实醇提物抗血栓作用及其机制研究

任 婧1,王进东1,2*,柴秋彦2,杨官娥1,卫 罡2

(1山西医科大学药学院中药学教研室,太原 030001;2山西省医药与生命科学研究院;*通讯作者,E-mail:844381238@qq.com)

目的 研究黄刺玫果实醇提物的抗血栓作用并探究其作用机制。 方法 ①将不同浓度的黄刺玫果实醇提物分别加入大鼠富血小板血浆中,用多功能血小板聚集仪测定ADP诱导血小板的最大聚集率。②将小鼠随机分为高、中、低三个剂量组,连续给药5 d,注射角叉菜胶诱导小鼠尾静脉血栓,分别在24 h和48 h后测量黑尾长度。③体外测定不同浓度黄刺玫果醇提物组血浆凝血酶时间(PT)、凝血酶时间(TT)、部分凝血酶原时间(APTT)。④在0,4,8,24 h时,分别称量黄刺玫果实醇提物高、中、低剂量(60,30,15 mg/ml)组,空白对照组和尿激酶阳性对照组的家兔全血凝块质量,计算全血凝块溶解率。 结果 ①与空白对照组比较,高、中、低剂量黄刺玫果醇提物组血小板最大聚集均明显减少(P<0.01)。②与空白组比较,黄刺玫提取物高、中剂量组小鼠相对黑尾长度及相对黑尾长度抑制率明显减少(P<0.05)。③与空白组比较,黄刺玫果醇提物组正常人血浆APTT,PT,TT时间均显著延长(P<0.01)。④与空白组比较,在4,8，24 h时,黄刺玫果醇提取物高、中剂量组的全血凝块溶解率均显著增加(P<0.01)。 结论 黄刺玫果实醇提物具有抗凝和抑制实验性血栓形成的作用。

黄刺玫果; 抗血栓; 血小板聚集; 凝血

黄刺玫果是蔷薇科蔷薇属落叶灌木黄刺玫(RosaxanthinaLindl.)的干燥成熟果实,黄刺玫果广泛分布于我国北方各省的山区和丘陵地带[1],据记载黄刺玫果具有理气活血、调经健脾的作用。黄刺玫果中含有大量维生素及黄酮类物质[2],具有抗衰老、抗氧化、抗疲劳等作用。据报道同种属植物山刺玫具有良好的的抗血栓作用[3],但关于黄刺玫果实并未深入研究。本文旨在从抗血小板聚集、抗凝血和抑制小鼠体内血栓形成等多方面来探讨其抗血栓作用,为黄刺玫果在心血管疾病中的合理利用提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司),92SM-202A-DR电子分析天平(瑞士Precisa),Sysmex CA-50 血凝仪,LG-PABER血小板聚集凝血因子分析仪(北京世帝科学仪器公司),PB-10型数显PH计(德国Sartorius),Allegra 64R台式高速冷冻离心机(美国贝克库曼尔特有限公司)。

1.1.2 试药 黄刺玫果(采自山西省左权县,经由王进东教授鉴定确认为黄刺玫果实)。尿激酶(南京南大药业责任有限公司,产品批号:20160107),胶原蛋白(Sigma,生产批号:091M7675),盐酸肾上腺素(天津金耀药业有限公司,生产批号:20151106),阿司匹林肠溶片(山西医科大学药厂,生产批号:20151013),角叉菜胶(Sigma,生产批号:021M0038V),曲克芦丁(山西亚宝药业,生产批号:20160423),正常人血血浆(从临床采集分离后的冻存血浆),部分凝血活酶时间测定试剂盒(上海太阳生物技术公司,生产批号:A107),凝血酶原时间测定试剂盒(北京世帝科学仪器有限公司,生产批号:STY2010-941),凝血酶时间测定试剂盒(北京世帝科学仪器有限公司,生产批号:STY20301-53),枸橼酸钠(市售AR级),二磷酸腺苷(ADP,美国Sigma公司)。

1.1.3 动物 大耳白家兔,普通级,雄性(2-2.5 kg);ICR小鼠,清洁级,雄性(22±2)g;SD大鼠,雄性(250±5)g,清洁级,购自中国食品药品检定研究院,许可证号为SCXK(京)2014-0013。

1.2 方法

1.2.1 黄刺玫果实醇提取物的制备 将黄刺玫干果粉碎后,与70% 的乙醇以1 ∶10混合,回流提取3次,每次1.5 h,提取液减压浓缩至干燥[4],所得干燥品即为实验所需样品。

1.2.2 黄刺玫果实醇提取物对ADP诱导大鼠血小板聚集的影响 样品溶液的配制:以蒸馏水为溶剂,将黄刺玫果实醇提物溶解,配制浓度为500 mg/ml的样品溶液,并依次稀释为250,125,62.5,31.75 mg/ml。

根据文献[5,6]实验方法改进。SD大鼠腹主动脉取血,3.2%枸橼酸钠与大鼠全血以1 ∶9抗凝,混合后所得全血以1 000 r/min,离心8 min后得富血小板血浆(PRP),将剩余的部分以3 000 r/min,离心10 min得贫血小板血浆(PPP)。设置空白对照组和样品组,样品组分别设置浓度为250,125,62.5,31.75 mg/ml的4个不同剂量组。以295 μl 贫血小板血浆加5 μl蒸馏水调零,样品组中加入295 μl富血小板血浆及5 μl各剂量组样品,空白对照组加入295 μl PRP和5 μl生理盐水,37 ℃温育60 s,加入15 μl诱导剂ADP溶液(0.5 mg/ml),每组6个平行样本,用多功能血小板聚集仪测定10 min内血小板的最大聚集率,并按照下列公式计算抑制率:血小板聚集抑制率(%)=(空白组血小板聚集率-样品组血小板聚集率)/空白组血小板聚集率×100%。

1.2.3 黄刺玫果实醇提物对角叉菜胶诱导小鼠尾静脉血栓模型的保护作用 样品溶液的配制:以蒸馏水为溶剂,将黄刺玫果实醇提取物溶解,配制浓度为15 mg/ml样品溶液,倍数稀释得到7.5,3.25 mg/ml溶液。

根据参考文献[7,8]方法改进。50只ICR小鼠，体质量(23±1)g,雄性,随机分为5组,每组10只,分别是空白对照组,黄刺玫果提取物高、中、低三个剂量组和曲克芦丁阳性对照组,按千克体质量给药,高、中、低剂量组给药量分别为2,1,0.5 g/kg,曲克芦丁注射液为100 mg/kg,空白对照组给予等体积生理盐水。按小鼠体质量0.2 ml/10 g腹腔注射样品组、阳性对照组和空白对照组,连续给药5 d,末次给药2 h后,按小鼠体质量0.1 ml/10 g,背部皮下注射1%角叉菜胶溶液。将小鼠置于室温20 ℃下48 h,于24,48 h时观察小鼠的黑尾情况,测量小鼠黑尾长度。结果以小鼠相对黑尾长度(relative black tail length,RATL)表示,按照下列公式计算相对黑尾长度及相对黑尾长度抑制率(%):RATL=每只小鼠黑尾长度/该小鼠的尾巴长度;RATL抑制率(%)=[1-(样品组RATL/空白组RATL)]×100%。

1.2.4 黄刺玫果实醇提物对正常人血浆APTT,PT,TT时间的影响 样品溶液的配制:以生理盐水为溶剂,将黄刺玫果实醇提物溶解,配制初始浓度为270 mg/ml的样品溶液。

PT时间测定:将样品溶液分别稀释为2.7,5.4,7.8,10.4 mg/ml,在血凝杯中加入46 μl血浆和4 μl不同浓度样品溶液。预热3 min后加入100 μl PT试剂,空白对照给予等量生理盐水,经血凝仪测定凝固时间,每组重复4次。

TT时间测定:将样品溶液分别稀释为9,12,15,18 mg/ml,在血凝杯中加入90 μl血浆和10 μl不同浓度样品溶液。空白对照给予等量生理盐水,预热3 min后加入50 μl TT试剂,经血凝仪测定凝固时间,每组重复4次。

APTT时间测定:将样品溶液分别稀释为2.2,4.5,9,18 mg/ml,在血凝杯中加入44 μl血浆和6 μl不同浓度样品溶液。空白对照给予等量生理盐水,预热1 min后加入5 μl APTT试剂,温育3 min后加入50 μl CaCl2,经血凝仪测定APTT时间,每组重复4次。

1.2.5 黄刺玫果实醇取物对家兔全血凝块溶解率的影响 样品溶液的配制:以生理盐水为溶剂,将黄刺玫果实醇提物溶解,配制浓度为60,30,15 mg/ml的样品溶液。

根据参考文献[9]方法进行改进。家兔心脏采血,置于直径约0.4 cm 的细长玻璃管中,37 ℃水浴锅中放置3 h,自然凝固后取出并将其分为长约1 cm的血凝块,生理盐水淋洗3次待用。黄刺玫果提取物设置高、中、低3个剂量组(60,30,15 mg/ml),以生理盐水为空白对照,尿激酶为阳性对照(1 000 U/ml)。将生理盐水、尿激酶及不同剂量组样品各2 ml加入玻璃试管中,每组5个平行样本,向每个试管中分别加入1个血块,37 ℃水浴温育24 h,观察血块溶解情况,并分别于0,4,8,24 h测定血凝块质量,按下列公式计算全血凝块溶解率:全血凝块溶解率(%)=(血凝块初始质量-样品作用后各时间点血凝块质量)/血凝块初始质量。

2 结果

2.1 黄刺玫果实醇提物对ADP诱导大鼠血小板聚集的影响

与空白组比较,500,250,125,62.5,31.75 mg/ml浓度的黄刺玫果实醇提物可以明显抑制血小板聚集,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

组别最大聚集率(%)抑制率(%)空白组3991±53-500mg/ml927±165∗∗7638250mg/ml1632±189∗∗5910125mg/ml2215±284∗∗4450625mg/ml2973±446∗∗25513175mg/ml3506±596∗1215

与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01

2.2 黄刺玫果实醇提物对角叉菜胶诱导小鼠尾静脉血栓模型的保护作用

与空白组比较,在24 h时,高剂量组未出现小鼠黑尾情况,中剂量组小鼠相对黑尾长度明显减少。48 h时,高剂量组相对黑尾长度明显减少,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)，表明高中剂量组黄刺玫果实提取物可以明显抑制角叉菜胶诱导小鼠体内血栓的形成。

组别血栓发生率(%)RATLRATL抑制率(%)24h48h24h48h24h48h空白组901001766±9052953±1225-阿司匹林组601001059±4472194±122540032570高剂量组070 0∗∗1558±177∗100．004724中剂量组20100624±684∗2042±153564673084低剂量组601001192±8652564±117632502069

与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01

2.3 黄刺玫果实醇提物对正常人血浆APTT,PT,TT的影响

与空白组比较,黄刺玫果实醇提物4个剂量组正常人血浆APTT,PT均显著延长。当黄刺玫果醇提物浓度为9,18 mg/ml,正常人血浆TT时间显著延长(P<0.01,见表3-5)，表明黄刺玫果醇提物对内源性凝血系统及外源性凝血系统均有抑制作用。2.4 黄刺玫果实醇提物对家兔全血凝块溶解的影响

随着给药时间的延长,各实验组血栓溶解率增加,血栓表面逐渐变松散,不再紧致有弹性并松散成颗粒状,与对照组相比,各剂量组随着给药时间的延长,全血凝块的溶解率逐渐增加,高、中剂量组在不同时间点均表现了较强的全血凝块溶解能力,差异有统计学意义(P<0.01,见表6)。

组别APTT(s)终浓度(mg/ml)空白组3665±0680270mg/ml4710±190∗0216540mg/ml7608±231∗∗0432780mg/ml8747±590∗∗0864104mg/ml 13480±1190∗∗1728

与空白组比较,*P<0.05，**P<0.01

组别PT(s)终浓度(mg/ml)空白组1333±00609mg/ml1570±025∗∗0912mg/ml1953±035∗∗1215mg/ml2630±081∗∗1518mg/ml3463±063∗∗18

与空白组比较,*P<0.05，**P<0.01

组别TT(s)终浓度(mg/ml)空白组1828±0280225mg/ml1825±025021645mg/ml2060±066∗0549mg/ml2425±088∗∗10818mg/ml3788±088∗∗206

与空白组比较,*P<0.05，**P<0.01

组别4h8h24h空白组161±047263±099834±179高剂量组2393±375∗∗3330±311∗∗4038±317∗∗中剂量组1266±127∗∗1966±268∗∗3054±224∗∗低剂量组259±079630±0991930±3054∗∗尿激酶组462±1621969±346∗∗4096±461∗∗

与空白组相比,*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

血栓形成是在生理或病理状态下,凝血系统不同程度被激活,循环血液中的有形分子在血液中形成的栓子。形成血栓的危险因素有很多,防治血栓形成必须从保护血管内皮细胞、降低血小板功能、抑制血液凝固、促进纤溶活性等多个途径来进行[10,11]。

角叉菜胶是从海藻中提取的硫酸多糖,一种常用的血栓诱导剂,角叉菜胶通过炎症损伤血管内皮细胞,激活外源性凝血系统形成血栓,并在血栓形成后抑制纤溶系统[12]。实验发现,黄刺玫果醇提物高剂量组可明显抑制小鼠尾静脉血栓形成。

血栓形成的重要原因之一是血小板聚集,二磷酸腺苷(ADP)是常用的血小板聚集剂之一,黄刺玫果提取物明显地抑制血小板聚集、黏附。

APTT,PT,TT是各自独立的基础性凝血途径筛查指标,APTT是内源性凝血途径筛查指标,PT是外源性凝血途径筛查指标,TT用于凝血酶测定,检查血浆纤维蛋白原转变为纤维蛋白能力。黄刺玫果实醇取物可以明显延长APTT,TT,表明其可以抑制内源性凝血途径;明显延长PT,表明其可以抑制外源性凝血途径。可推测黄刺玫果实醇提物能够抑制外源性和内源性凝血途径,从而抑制凝血酶的表达,最终达到抗血栓目的,但对于黄刺玫果提取物是否可以直接抑制凝血酶作用仍待研究。

体外抗血栓实验通过观察黄刺玫果提取物对体外血块的溶解能力,表明黄刺玫果提取物对已凝聚的血栓块也有一定的作用,推测其可能与激活血凝块中的纤溶酶有关。

通过以上实验研究表明黄刺玫果实醇提物具有良好的抗血栓作用。在对其抗血栓机制作用的实验研究中,黄刺玫果实醇提物体现了广泛的抗血栓作用。黄刺玫果作为一种天然产物,良好的抗血栓作用对于开发抗血栓药物有很大的前景及价值。但该实验并未对其具体的抗血栓作用机制探讨清楚,所以对于黄刺玫果抗血栓作用机制仍有待于继续研究。

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Study on antithrombotic effects ofRosaxanthinaLindl.fruit and its mechanism

REN Jing1,WANG Jindong1,2*,CHAI Qiuyan2,YANG Guan’e1,WEI Gang2

(1DepartmentofChineseTraditionalMedicine,CollegeofPharmacy,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2ShanxiInstituteofMedicineandLifeScience;*Correspondingauthor,E-mail:844381238@qq.com)

ObjectiveTo explore the antithrombotic effect ofRosaxanthinaLindl.fruit alcohol extract and its possible mechanism.Methods①The ADP-induced platelet aggregation was measured using multifunctional platelet aggregometer after the different concentrations of the alcohol extract of Rosa xanthina Lindl.fruit were added into rat platelet rich plasma,respectively.②The mice were randomly allocated into five groups: blank group,positive control group,low-dose group,medium-dose group and high-dose group.The tail-thrombus models were established by carrageenan after the mice were fed for 5 d.The length of dark tails was observed after the models were established for 24 h and 48 h.③The prothrombin time(PT),thrombin time(TT) and activated partial thermoplastic time(APTT) of human plasma were determined in different dose groups.④At 0,4,8,24 h,the blood clots were weighed in different dose groups,and the blood clot dissolution was calculated.Results①Compared with control group,the platelet maximum aggregation was significantly reduced in high-dose group,medium-dose group and low-dose group(P<0.01).②Compare with control group,the relative black tail length and relative black tail length inhibition rate were significantly reduced in high-dose group and medium-dose group(P<0.01).③Compared with control group,APTT,TT,PT were prolonged inRosaxanthinaLindl.fruit alcohol extract groups(P<0.01).④At 4,8,24 h,the blood clots dissolution were significantly increased by extract ofRosaxanthinaLindl.fruit in high-dose and medium-dose groups(P<0.01).ConclusionThe extract ofRosaxanthinaLindl.fruit may have good anticoagulation and antithrombotic effects.

RosaxanthinaLindl.fruit; anti-thrombosis; platelet aggregation; thrombin

山西省国际科技合作项目(2014081049-2)

任婧,女,1991-02生,在读硕士,E-mail:renjing0209@163.com

2017-02-22

R965

A

1007-6611(2017)06-0539-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.006