新型20(S)-O-取代苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯的合成及其抗肿瘤活性

王佳乐, 高 鹏, 蔡 冉, 王浦海, 孙 立, 袁胜涛

(1. 南京工业大学 a. 药学院， b. 江苏省药物研究所，江苏 南京 211816；2. 中国药科大学 国家南京新药筛选中心，江苏 南京 210009)

·研究论文·

新型20(S)-O-取代苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯的合成及其抗肿瘤活性

王佳乐1a, 高 鹏1a, 蔡 冉1a, 王浦海1b*, 孙 立2*, 袁胜涛2

(1. 南京工业大学 a. 药学院， b. 江苏省药物研究所，江苏 南京 211816；2. 中国药科大学 国家南京新药筛选中心，江苏 南京 210009)

以20(S)-喜树碱为起始原料，对其进行结构修饰，在7-位导入苯甲酰基，在20-位羟基上导入取代苯甲酰基，设计并合成了11个新的20(S)-O-取代苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯化合物(4a～4k)，其结构经1H NMR， IR，，MS(ESI)和元素分析表征。采用MTT法初步考察了目标化合物4a～4j对人胃癌细胞(BGC-823)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肺腺癌细胞(H460)及人肝癌细胞(Bel-7404)的体外抑制活性。结果表明：化合物4a、 4g和4h具有一定的体外抑瘤活性。在药物浓度为10 μmol·L-1时，4a对MDA-MB-231细胞和H460细胞的抑制率分别为50.42%和54.40%， 4g对MDA-MB-231细胞的抑制率为69.91%， 4h对H460细胞抑制率为52.34%。

喜树碱; 7-苯甲酰基喜树碱; 喜树碱酯; 合成; 抗肿瘤活性

喜树碱是从喜树中分离得到的具有抗肿瘤活性的生物碱[1-2]。因喜树碱存在溶解性差、E环内酯易开环不稳定及毒性高等问题，严重影响其临床应用。近年来，人们对喜树碱进行了大量的结构修饰研究，以减少毒副作用，提高抗肿瘤活性。喜树碱的构效关系研究表明，在7-位导入可以与喜树碱的芳环形成更大共轭体系的亲脂性基团(如苯甲酰基)[3-6]，可以提高药物的脂溶性，增加稳定性，延长药物在体内代谢时间，减少给药量，增加抗肿瘤活性，降低药物对人体的伤害；将喜树碱的20-位羟基与有机酸进行酯化[7-11]，可消除喜树碱分子内氢键，增加E环内酯羰基的位阻，提高内酯环的稳定性，减缓内酯环在体内开环，也有利于提高抗肿瘤活性。

本文拟在喜树碱的7-位导入苯甲酰基，同时在20-位羟基上导入取代苯甲酰基，以期使二者发挥协同作用，在增加喜树碱脂溶性的同时保持内酯环稳定性，达到提高抗肿瘤活性和减少毒副作用的目的。以20(S)-喜树碱(1)为起始原料，H2O2-FeSO4作为自由基引发剂，与苯甲醛反应，在喜树碱的7-位上导入苯甲酰基制得20(S)-7-苯甲酰基喜树碱(2)；继而以EDCI-DMAP为缩合剂，将2与取代苯甲酸(3a～3k)反应，在20-位羟基上导入取代苯甲酰基合成了11个新型的20(S)-O-取代苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯化合物(4a～4k， Scheme 1)，其结构经1H NMR， IR， MS(ESI)和元素分析表征。采用MTT法初步考察了4a～4j对人肝癌细胞(Bel-7404)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人胃癌细胞(BGC-823)和人肺腺癌细胞(H460)的体外抑瘤活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SGW X-4型数字显微熔点仪(温度未校正)；AVANCE AV-300型或AVANCE AV-500型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；Nicolet iS10型傅立叶变换红外光谱仪(KBr压片)；Waters Q-TOF Micro型质谱仪；Elementar Vario EL III型元素分析仪；Essentia LC-15C型高效液相色谱仪[Luna C18硅胶柱，流动相：甲醇/水(80/20,V/V)，检测波长：267 nm]。

1(99.26%)，成都澜绮制药有限公司；1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI， 99.3%)和4-二甲氨基吡啶(DMAP， 99.4%)，苏州昊帆生物科技有限公司；薄层层析硅胶板GF254，烟台德信生物科技有限公司 ；柱层析硅胶(100～200目)，青岛海洋化工有限公司；其余试剂均为分析纯，其中CH2Cl2使用前经CaH2回流干燥处理。

1.2 合成

(1) 2的合成[3-5,12]

在反应瓶中加入1 6.00 g(17.2 mmol)和冰醋酸240 mL，搅拌使其均匀，于5～10 ℃缓缓滴加98%浓硫酸60 mL，滴毕得黄色喜树碱溶液。在另一反应瓶中加入FeSO4·7H2O 12.0 g(43.2 mmol)和去离子水360 mL，搅拌使其溶解，冰浴冷却下(2～4 ℃)加入上述喜树碱溶液，搅拌均匀，滴加苯甲醛18.0 mL(177 mmol)，滴毕，缓慢滴加30%H2O218.0 mL(177 mmol)，滴毕(约30 min)，反应约8 h[TLC监测，展开剂：氯仿/丙酮=5/1(V/V)]。用氯仿(6×50 mL)萃取，萃取液依次用饱和NaHCO3溶液洗涤、无水Na2SO4干燥，减压浓缩后经硅胶柱层析[洗脱剂：氯仿/甲醇=200/1(V/V)]纯化得亮黄色粉末2 3.50 g，收率44.9%，纯度99.82%(HPLC面积归一化，下同)，m.p.251～254 ℃(>200 ℃[12], 237～238 ℃[3])；1H NMR(300 MHz)δ: 1.04(t,J=7.3 Hz, 3H, 18-H), 1.82～1.96(m, 2H, 19-H), 3.86(s, 1H, 20-OH), 5.07(s, 2H, 5-H), 5.26(d,J=16.5 Hz, 1H, 17-H), 5.69(d,J=16.5 Hz, 1H, 17-H), 7.52(t,J=7.5 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.60(t,J=7.5 Hz, 1H, 10-H), 7.69(d,J=7.5 Hz, 1H, 26-H), 7.72(s, 1H, 14-H), 7.76(t,J=8.5 Hz, 1H, 11-H), 7.85(t,J=7.5 Hz, 3H, 9,24,24′-H), 8.31(d,J=8.5 Hz, 1H, 12-H)； IRν: 3 316, 3 061, 2 965, 2 937, 2 877, 1 751, 1 663, 1 606, 1 448, 1 311, 1 227, 1 155, 1 058, 769, 724 cm-1； MS(ESI)m/z: 451.1{[M-H]-}。

Scheme 1

(2) 4a～4k的合成(以4a为例)[5,8,10-11]

在反应瓶中加入苯甲酸(3a)0.73 g(6 mmol)和CH2Cl2120 mL，搅拌使其溶解；冰浴冷却下(2 ℃)依次加入2 0.90 g(2 mmol), EDCI 1.91 g(10 mmol)和DMAP 1.46 g(12 mmol)，避光反应15 min，撤去冰浴，于室温反应3 h得橙黄色澄清溶液。依次用冰水、稀盐酸、饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，减压浓缩后经硅胶柱层析[梯度洗脱剂：CH2Cl2/THF=45/1～15/1(V/V)]纯化得亮黄色粉末，用CH2Cl2重结晶得4a 0.80 g。

用类似的方法合成化合物4b～4k。

20(S)-O-苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯(4a)：收率72.7%，纯度99.65%， m.p. 281～282 ℃；1H NMRδ: 1.10(t,J=7.4 Hz, 3H, 18-H), 2.32(q,J=7.1 Hz, 1H, 19-H), 2.47(q,J=7.1 Hz, 1H, 19-H), 5.01(d,J=19.4 Hz, 1H, 5-H), 5.10(d,J=19.4 Hz, 1H, 5-H), 5.43(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 5.72(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 7.32(s, 1H, 14-H), 7.51(t,J=7.6 Hz, 4H, 25,25′,30,32-H), 7.57～7.72(m, 3H, 10,11,26-H), 7.75～7.85(m, 4H, 9,24,24′,31-H), 8.14(d,J=7.6 Hz, 2H, 29,33-H), 8.25(d,J=8.5 Hz, 1H, 12-H)； IRν: 3 062, 2 978, 2 948, 2 882, 1 760, 1 729, 1 664, 1 610, 1 451, 1 276, 1 230, 1 157, 1 098, 765, 712 cm-1； MS(ESI)m/z: 555.1{[M-H]-}； Anal. calcd for C34H24N2O6: C 73.37, H 4.35, N 5.03, found C 73.18, H 4.41, N 4.93。

20(S)-O-对氟苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯(4b)： 黄色粉末，收率74.0%，纯度98.28%， m.p.289～290 ℃；1H NMR(500 MHz)δ: 1.09(t,J=7.4 Hz, 3H, 18-H), 2.31(q,J=7.4 Hz, 1H, 19-H), 2.45(q,J=7.4 Hz, 1H, 19-H), 5.02(d,J=19.4 Hz, 1H, 5-H), 5.09(d,J=19.4 Hz, 1H, 5-H), 5.43(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 5.72(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 7.17(t,J=8.6 Hz, 2H, 30,32-H), 7.27(s, 1H, 14-H), 7.50(t,J=7.7 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.59(t,J=7.4 Hz, 1H, 10-H), 7.69(t,J=7.4 Hz, 1H, 11-H), 7.76(d,J=8.3 Hz, 1H, 9-H), 7.79～7.84(m,J=7.7 Hz, 3H, 24,24′,26-H), 8.13～8.16(m, 2H, 29,33-H), 8.23(d,J=8.5 Hz, 1H, 12-H)； IRν: 3 067, 2 983, 2 946, 2 883, 1 759, 1 729, 1 667, 1 608, 1 507, 1 450, 1 312, 1 276, 1 230, 1 155, 1 102, 767, 723 cm-1； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C34H22N2O6F{[M-H]-}573.146 2, found 573.147 6。

20(S)-O-对氯苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯(4c)： 类白色粉末，收率67.8%，纯度95.02%，m.p.297～298 ℃；1H NMR(300 MHz)δ: 1.09(t,J=7.3 Hz, 3H, 18-H), 2.31(q,J=7.3 Hz, 1H, 19-H), 2.46(q,J=7.3 Hz, 1H, 19-H), 5.05(d,J=19.4 Hz, 1H, 5-H), 5.09(d,J=19.4 Hz, 1H, 5-H), 5.43(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 5.72(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 7.27(s, 1H, 14-H), 7.48(d,J=8.6 Hz, 2H, 30, 32-H), 7.50(t,J=7.7 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.59(t,J=7.5 Hz, 1H, 10-H), 7.67(t,J=7.6 Hz, 1H, 11-H), 7.75～7.85(m, 4H, 9,24,24′,26-H), 8.06(d,J=8.6 Hz, 2H, 29,33-H), 8.24(d,J=8.5 Hz, 1H, 12-H)； IRν: 3 059, 2 978, 2 929, 2 873, 1 765, 1 732, 1 667, 1 615, 1 450, 1 276, 1 225, 1 156, 1 102, 1 014, 833, 766, 723 cm-1； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C34H22N2O6Cl{[M-H]-}589.116 7, found 589.118 1。

20(S)-O-对溴苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯(4d)： 淡黄色粉末，收率63.1%，纯度94.74%， m.p.297～298 ℃；1H NMR(300 MHz)δ: 1.09(t,J=7.5 Hz, 3H, 18-H), 2.31(q,J=7.0 Hz, 1H, 19-H), 2.46(q,J=7.0 Hz, 1H, 19-H), 5.01(d,J=19.5 Hz, 1H, 5-H), 5.10(d,J=19.5 Hz, 1H, 5-H), 5.43(d,J=17.5 Hz, 1H, 17-H), 5.72(d,J=17.5 Hz, 1H, 17-H), 7.29(s, 1H, 14-H), 7.51(t,J=7.6 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.57～7.70(m, 4H, 10,11,30,32-H), 7.72～7.86(m, 4H, 9,24,24′,26-H), 7.98(d,J=8.5 Hz, 2H, 29,33-H), 8.26(d,J=8.4 Hz, 1H, 12-H)； IRν: 3 059, 2 986, 2 930, 2 871, 1 766, 1 732, 1 667, 1 614, 1 593, 1 450, 1 277, 1 225, 1 103, 766, 723 cm-1； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C34H22N2O6Br{[M-H]-}633.066 1, found 633.067 6。

20(S)-O-对碘苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯(4e)： 淡黄色粉末，收率58.7%，纯度99.15%，m.p.288～290 ℃；1H NMR(300 MHz)δ: 1.09(t,J=7.4 Hz, 3H, 18-H), 2.30(q,J=7.1 Hz, 1H, 19-H), 2.43(q,J=7.1 Hz, 1H, 19-H), 5.01(d,J=19.5 Hz, 1H, 5-H), 5.10(d,J=19.5 Hz, 1H, 5-H), 5.42(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 5.72(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 7.28(s, 1H, 14-H), 7.51(t,J=7.8 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.60(t,J=7.5 Hz, 1H, 10-H), 7.67(t,J=7.2 Hz, 1H, 11-H), 7.75～7.89(m, 8H, 9,24,24′,26,29,30,32,33-H), 8.26(d,J=8.3 Hz, 1H, 12-H)； IRν: 3 066, 2 936, 2 879, 1 753, 1 726, 1 666, 1 611, 1 451, 1 276, 1 231, 1 097, 1 010, 754, 723 cm-1； MS(ESI)m/z: 681.1 {[M-H]-}； Anal. calcd for C34H23N2O6I: C 59.84, H 3.40, N 4.10, found C 60.04, H 3.49, N 3.59。

20(S)-O-对硝基苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯(4f)： 淡黄色粉末，收率73.2%，纯度96.97%，m.p.286～287 ℃；1H NMR(300 MHz)δ: 1.11(t,J=7.4 Hz, 3H, 18-H), 2.34(q,J=7.1 Hz, 1H, 19-H), 2.48(q,J=7.2 Hz, 1H, 19-H), 5.03(d,J=19.5 Hz, 1H, 5-H), 5.12(d,J=19.5 Hz, 1H, 5-H), 5.44(d,J=17.5 Hz, 1H, 17-H), 5.74(d,J=17.5 Hz, 1H, 17-H), 7.30(s, 1H, 14-H), 7.51(t,J=7.7 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.61(t,J=7.2 Hz, 1H, 10-H), 7.70(t,J=7.5 Hz, 1H, 11-H), 7.79～7.86(m, 4H, 9,24,24′,26-H), 8.23～8.37(m, 5H, 12,29,30,32,33-H)； IRν: 3 071, 2 888, 1 764, 1 738, 1 665, 1 614, 1 526, 1 451, 1 278, 1 225, 1 105, 766, 721 cm-1； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C34H22N3O8{[M-H]-}600.140 7, found 600.142 1。

20(S)-O-间硝基苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯(4g)： 淡黄色粉末，收率75.7%，纯度97.68%， m.p.278～280 ℃；1H NMR(300 MHz)δ: 1.12(t,J=7.4 Hz, 3H, 18-H), 2.36(q,J=7.1 Hz, 1H, 19-H), 2.51(q,J=7.1 Hz, 1H, 19-H), 5.07(s, 1H, 5-H), 5.08(s, 1H, 5-H), 5.45(d,J=17.7 Hz, 1H, 17-H), 5.74(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 7.29(s, 1H, 14-H), 7.51(t,J=7.7 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.60(t,J=7.6 Hz, 1H, 10-H), 7.68～7.86(m, 6H, 9,11,24,24′,26,32-H), 8.24(d,J=8.6 Hz, 1H, 12-H), 8.42(d,J=7.7 Hz, 1H, 33-H), 8.50(d,J=7.1 Hz, 1H, 31-H), 8.97(s, 1H, 29-H)； IRν: 3 070, 2 982, 2 941, 2 882, 1 768, 1 734, 1 669, 1 617, 1 533, 1 451, 1 350, 1 298, 1 267, 1 226, 1 126, 769, 720 cm-1； MS(ESI)m/z: 600.2{[M-H]-}； Anal. calcd for C34H23N3O8: C 67.88, H 3.85, N 6.99, found C 67.80, H 3.86, N 6.68。

20(S)-O-(3, 5-二硝基)苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯(4h)： 土黄色粉末，收率43.3%，纯度93.40%， m.p.247～250 ℃；1H NMR(300 MHz)δ: 1.14(t,J=7.3 Hz, 3H, 18-H), 2.39(q,J=7.2 Hz, 1H, 19-H), 2.54(q,J=7.1 Hz, 1H, 19-H), 5.05(d,J=19.8 Hz, 1H, 5-H), 5.12(d,J=19.7 Hz, 1H, 5-H), 5.45(d,J=17.6 Hz, 1H, 17-H), 5.75(d,J=17.6 Hz, 1H, 17-H), 7.26(s, 1H, 14-H, CHCl3), 7.51(t,J=7.4 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.60(t,J=7.6 Hz, 1H, 10-H), 7.70(t,J=7.5 Hz, 1H, 11-H), 7.75～7.85(m, 4H, 9,24,24′,26-H), 8.20(d,J=8.7 Hz, 1H, 12-H), 9.21(s, 2H, 29,33-H), 9.29(s, 1H, 31-H)；1H NMR(DMSO-d6, 300 MHz)δ: 1.08(t,J=7.0 Hz, 3H, 18-H), 2.45(d,J=7.1 Hz, 2H, 19-H), 5.01(s, 2H, 5-H), 5.58(s, 2H, 17-H), 7.47(s, 1H, 14-H), 7.59(t,J=7.4 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.64～7.91(m, 6H, 9,10,11,24,24′,26-H), 8.18(d,J=8.6 Hz, 1H, 12-H), 9.13(s, 3H, 29,31,33-H)； IRν: 3 099, 2 939, 1 742, 1 666, 1 613, 1 547, 1 452, 1 345, 1 278, 1 228, 1 155, 1 075, 770, 720 cm-1； MS(ESI)m/z: 645.1{[M-H]-}； Anal. calcd for C34H22N4O10: C 63.16, H 3.43, N 8.67, found C 63.23, H 3.59, N 8.26。

20(S)-O-对三氟甲基苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯(4i)： 淡黄色粉末，收率63.3%，纯度99.60%， m.p.295～296 ℃；1H NMR(300 MHz)δ: 1.11(t,J=7.4 Hz, 3H, 18-H), 2.33(q,J=7.2 Hz, 1H, 19-H), 2.48(q,J=7.2 Hz, 1H, 19-H), 4.99(d,J=19.4 Hz, 1H, 5-H), 5.11(d,J=19.4 Hz, 1H, 5-H), 5.44(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 5.73(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 7.29(s, 1H, 14-H), 7.51(t,J=7.7 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.60(t,J=7.4 Hz, 1H, 10-H), 7.70(t,J=7.5 Hz, 1H, 11-H), 7.76～7.86(m, 6H, 9,24,24′,26,30,32-H), 8.25(d,J=8.3 Hz, 3H, 12,29,33-H)； IRν: 3 068, 2 986, 2 950, 2 890, 1 767, 1 737, 1 667, 1 613, 1 450, 1 329, 1 279, 1 227, 1 157, 1 108, 1 066, 768, 724 cm-1； MS(ESI)m/z: 623.1{[M-H]-}； Anal. calcd for C35H23N2O6F3: C 67.31, H 3.71, N 4.49, found C 66.91, H 3.56, N 4.25。

20(S)-O-间三氟甲基苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯(4j)： 淡黄色粉末，收率65.7%，纯度95.50%， m.p.279～280 ℃；1H NMR(300 MHz)δ: 1.11(t,J=7.5 Hz, 3H, 18-H), 2.35(q,J=7.0 Hz, 1H, 19-H), 2.50(q,J=7.0 Hz, 1H, 19-H), 5.06(s, 1H, 5-H), 5.08(s, 1H, 5-H), 5.44(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 5.74(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 7.31(s, 1H, 14-H), 7.51(t,J=7.7 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.60(t,J=7.6 Hz, 1H, 10-H), 7.66～7.86(m, 6H, 9,11,24,24′,26,32-H), 7.90(d,J=8.0 Hz, 1H, 12-H), 8.25(d,J=8.5 Hz, 1H, 31-H), 8.31(d,J=7.7 Hz, 1H, 33-H), 8.38(s, 1H, 29-H)； IRν: 3 061, 2 981, 2 941, 2 882, 1 769, 1 732, 1 670, 1 618, 1 452, 1 338, 1 254, 1 125, 1 072, 766, 724 cm-1； MS(ESI)m/z: 623.1{[M-H]-}； Anal. calcd for C35H23N2O6F3: C 67.31, H 3.71, N 4.49, found C 67.16, H 3.67, N 4.27。

20(S)-O-对氰基苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯(4k)： 淡黄色粉末，收率34.4%，纯度96.85%， m.p.285～286 ℃；1H NMR(300 MHz)δ: 1.12(t,J=7.4 Hz, 3H, 18-H), 2.34(q,J=7.1 Hz, 1H, 19-H), 2.48(q,J=7.1 Hz, 1H, 19-H), 5.04(d,J=19.5 Hz, 1H, 5-H), 5.13(d,J=19.4 Hz, 1H, 5-H), 5.45(d,J=17.5 Hz, 1H, 17-H), 5.74(d,J=17.4 Hz, 1H, 17-H), 7.29(s, 1H, 14-H), 7.52(t,J=7.3 Hz, 2H, 25,25′-H), 7.62(t,J=7.6 Hz, 1H, 10-H), 7.72(t,J=7.3 Hz, 1H, 11-H), 7.77～7.88(m, 6H, 9,24,24′,26,30,32-H), 8.23～8.27(m, 3H, 12,29,33-H)； IRν: 3 058, 2 979, 2 929, 2 873, 2 232, 1 766, 1 737, 1 665, 1 614, 1 450, 1 278, 1 225, 1 155, 1 058, 1 104, 765, 724 cm-1； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C35H22N3O6{[M-H]-}580.150 9, found 580.152 3。

1.3 体外抗肿瘤活性试验[10-11,13-14]

以紫杉醇作为阳性对照药，采用MTT法测定化合物4a～4j的体外抗肿瘤活性。取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数(2～4)×104个/mL，制成细胞悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，180 μL/孔，置恒温CO2培养箱中培养24 h。换液，加入受试药物，20 μL/孔，培养72 h。将MTT试剂加入96孔板中，20 μL/孔，培养箱中反应4 h。吸去上清液，加入DMSO， 150 μL/孔，平板摇床上振摇5 min。用酶联免疫检测仪在波长为570 nm处测定每孔的吸光值(OD)，重复试验3次取平均值，按下式计算肿瘤细胞抑制率(%)。

2 结果与讨论

2.1 合成

以1为起始原料，用H2O2-FeSO4作为自由基引发剂，与苯甲醛反应制得2。参考文献方法，以50%乙酸-浓硫酸(V/V=9.4/1)[12]，或75%浓硫酸[3]为溶剂，反应很难进行。推测反应体系含水不利于喜树碱溶解，进而影响反应进行。借鉴文献方法[4,10-11]，采用冰醋酸/浓硫酸(V/V=4/1)混合溶剂，取得了较好的试验结果。

在合成化合物4a～4k的酯化反应中，以位阻较小的碳二亚胺EDCI及DMAP碱作为缩合剂[5,10-11]，当2, 3, EDCI和DMAP投料比(摩尔比)为1 ∶3 ∶5 ∶6时，反应约3 h进行完全，且反应后处理简单，收率大多可达60%以上(含柱层析精制步骤)。另外产物4a～4k在有机溶剂(如二氯甲烷)中的溶解性较之喜树碱明显增加。

2.2 表征

采用1H NMR， IR， MS(ESI)和元素分析对目标化合物4a～4k的结构进行了表征，测定结果与Scheme 1预期结构吻合。依据ChemDraw软件拟合数据以及实测化学位移值、耦合裂分数据，参考文献报道的喜树碱类化合物数据，对4a～4k的1H NMR谱图进行了初步的归属。

在测定化合物4的1H NMR谱时，有时会出现溶剂峰掩盖样品信号峰的情况。以CDCl3作溶剂，化合物4h的1H NMR谱氢质子总数缺少1个H，推测是溶剂CDCl3峰残留质子峰(δ7.26)掩盖了化合物4h结构中14-H峰(δ7.26)。改换DMSO-d6作溶剂，可观察到丢失的14-H吸收峰(δ7.47, s, 1H)。此外还可以观察到，选择CDCl3作溶剂比DMSO-d6具有更好的精细结构区分度。化合物4h在DMSO-d6中，5,17-H皆为单峰(δ分别为5.01, 5.58)；而在CDCl3中可观察到5-H和17-H皆为四重峰：δ5.05(d,J=19.8 Hz, 1H, 5-H),δ5.12(d,J=19.7 Hz, 1H, 5-H),δ5.45(d,J=17.6 Hz, 1H, 17-H),δ5.75(d,J=17.6 Hz, 1H, 17-H)。

2.3 抗肿瘤活性

4a～4j对人肝癌细胞(Bel-7404)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人胃癌细胞(BGC-823)和人肺腺癌细胞(H460)的体外抑瘤活性测试结果见表1。由表1可见，在试药浓度为10 μmol·L-1时，多个化合物表现出明显的体外抑瘤活性。其中化合物4a对MDA-MB-231细胞和H460细胞的抑制率超过了50%；化合物4g对MDA-MB-231细胞有着较高的体外活性，抑制率近70%，化合物4h对H460细胞抑制率也超过了50%。

4g和4h都是具有间位硝基取代苯甲酸结构喜树碱酯，提示在此类化合物中，间位硝基取代对提高抑瘤活性具有积极作用。

表1 目标化合物4a～4j对肿瘤细胞的抑制率*

*c=10 μmol·L-1，人肝癌细胞：Bel-7404，人乳腺癌细胞：MDA-MB-231，人胃癌细胞：BGC-823，人肺腺癌细胞：H460。

以20(S)-喜树碱为起始化合物，对其7-位及20-位羟基上进行结构修饰，设计并合成了11个新的20(S)-O-取代苯甲酸-7-苯甲酰基喜树碱酯化合物。采用MTT法初步考察了目标化合物的抗肿瘤活性。结果表明：多个化合物显示出一定的体外抑瘤活性。在试药浓度为10 μmol·L-1时，化合物4a对MDA-MB-231细胞和H460细胞的抑制率超过了50%，化合物4g对MDA-MB-231细胞的抑制率近70%，化合物4h对H460细胞抑制率也超过了50%。尚未发现体外抑瘤活性非常优异的化合物。

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Synthesis and Antitumor Activities of Novel 20(S)-O-Linked Substituted Benzoic Acid-7-Benzoylcamptothecin Esters

WANG Jia-le1a, GAO Peng1a, CAI Ran1a,WANG Pu-hai1b*, SUN Li2*, YUAN Sheng-tao2

(a. School of Pharmaceutical Sciences; b. Jiangsu Institute of Materia Medica, 1.Nanjing Tech University, Nanjing 211816,China; 2. National Nanjing Center for Drug Screening, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Eleven novel 20(S)-O-linked substituted benzoic acid-7-benzoylcamptothecin esters(4a～4k) were designed and synthesized by structural modificationviaintroduction of benzoyl on 7-position and substituted-benzoyl on 20-hydroxyl, using 20(S)-campothecin as the starting material. The structures were characterized by1H NMR, IR, MS(ESI) and elemental analysis. The preliminary antitumor activities of 4a～4j against BGC-823, MDA-MB-231, H460 and Bel-7404 cellsinvitrowere investigated by MTT assay. The results showed that 4a, 4g and 4h exhibited certain antitumor activities. Inhibition rates were 50.42% against MDA-MB-231 and 54.40% against H460 for 4a, 69.91% against MDA-MB-231 for 4g and 52.34% against H460 for 4h at 10 μmol·L-1, respectively.

camptothecin; 7-benzoylcamptothecin; camptothecin ester; synthesis; antitumor activity

2017-02-26；

2017-03-23

国家自然科学基金资助项目(81102853, 81071841)

王佳乐(1990-)，女，汉族，江苏靖江人，硕士研究生，主要从事药物合成研究。

王浦海，研究员， Tel. 025-58139409, E-mail: wangpuhai@hotmail.com； 孙立，副研究员， Tel. 025-83271057, E-mail: cpusunli@126.com

O626； R914.5

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.07.17037