新城疫病毒SD强毒株全长cDNA克隆的构建及序列分析

袁小远+杨金兴+张玉霞+孟凯+王友令+艾武

摘要：将新城疫病毒SD强毒株的全基因组cDNA序列进行分段扩增，并将各个片段通过In-Fusion技术连于克隆载体pBR322上，获得了SD毒株的全基因组cDNA克隆。通过分段PCR扩增鉴定及全长测序分析，结果表明，SD毒株的全基因组cDNA克隆构建成功，并且成功引入T7启动子序列，全长基因组序列与亲本毒氨基酸序列的一致性为99.9%。单个序列比对发现，全基因组cDNA克隆中有11处碱基突变，其中只有2处引起氨基酸序列发生改变；整个序列未出现基因的缺失、插入变化，因此全长氨基酸的位数未发生任何变化。SD毒株全长cDNA克隆的成功构建和序列分析为后续的反向遗传操作奠定了关键的技术基础。

关键词：新城疫病毒；基因组全长cDNA；重组质粒；序列分析

中图分类号：S852.65+9.5：Q781 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）07-0012-04

Abstract The whole genomic cDNA sequence of SD virulent strain of Newcastle disease virus was amplified in sections， and each fragment was attached to the clone vector pBR322 by In-Fusion technology. The whole genomic cDNA clone was obtained. Through the fragmented-PCR amplification and sequencing analysis， the results showed that the whole genomic cDNA clone of SD virulent strain was successfully constructed and the T7 promoter sequence was successfully imported. The identity of amino acid sequence between the whole genomic cDNA clone and parent strain was 99.9%. Single sequence alignment showed that there were 11 base mutations in the whole genomic cDNA clone， and only 2 sites caused the change of amino acid sequence. However， because of no occurrence of deletion and insertion of genes in the whole sequence， the number of full-length amino acids had no change. The successful construction and sequence analysis of whole genomic cDNA clone of SD virulent strain laid the key technical foundations for future reverse genetic operation.

Keywords Newcastle disease virus； Whole genomic cDNA； Recombinant plasmid； Sequence analysis

新城疫（Newcastle disease，ND）是一种禽类的高度接触性疾病，对全世界养禽业造成巨大经济损失[1，2]。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）基因組是单股负链不分节段的RNA，病毒基因组包括六个结构基因，基因组全长为15 186 bp（或15 192 bp）[3]。单独的NDV RNA在细胞内不能够进行转录和翻译蛋白，需要核衣壳蛋白、磷蛋白和大分子蛋白组成核糖核蛋白复合物才能行使转录和翻译的功能[4，5]。

反向遗传操作技术是指将RNA病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在体外通过基因突变、基因插入、基因敲除、基因置换等方法人为构建新的具有感染性的病毒，来研究病毒的基因组结构、功能及和病毒宿主之间的相互作用等，也叫全长感染性cDNA克隆技术。这一技术解决了RNA病毒基因组难以操作的难题，同时为新型疫苗的研发提供了新的思路。目前，国内外已在NDV的反向遗传方面做了许多工作，成功构建并拯救了多株NDV感染性克隆病毒[5-7]。构建全长基因组克隆是进行反向遗传操作的关键技术步骤和核心决定因素。因此，本研究拟构建NDV病毒SD强毒株的基因组全长cDNA克隆，为NDV的反向遗传技术研究提供必要的技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

NDV的SD强毒株由山东SPF鸡研究中心分离鉴定保存，pBR322改良载体和感受态大肠杆菌HST08由山东SPF鸡研究中心制备保存。Gflex DNA聚合酶及PCR产品、In-Fusion HD克隆试剂盒、限制性内切酶等购自宝生物工程（大连）有限公司，Simple RNA kit购自博日生物有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 参照GenBank中NDV的全基因组序列（No：KU342001）设计3对引物，用于扩增NDV全基因组cDNA（表1）。引物由华大基因公司合成，PAGE plus级别纯化。

1.2.2 RNA的提取和反转录 病毒RNA的提取按照Simple RNA kit操作说明进行，最后用30 μL DEPC水溶解RNA。反转录RT按照文献[8]的操作进行，cDNA产物-20℃保存。

1.2.3 cDNA的分段擴增 将病毒cDNA分三段进行扩增，依次连接于经ClaⅠ酶切的pBR322载体上。具体扩增示意图见图1。

（1）片段In-PCR1的扩增克隆。cDNA产物2 μL、2×Gflex PCR Buffer（Mg2+、dNTP plus）25 μL、Tks Gflex DNA Polymerase （1.25 U/μL） 1 μL、cDNA-1F和cDNA-1R（20 pmol/μL）各1 μL，加水补至50 μL。反应条件94℃ 1 min；98℃ 10 s、55℃ 15 s、68℃ 3 min，共进行32个循环；4℃保存。将扩增得到的In-PCR1产物纯化后与经ClaⅠ酶切的 pBR322载体经In-Fusion HD体系进行连接，50℃作用15 min。取连接产物2 μL热转化至E. coli HST08 Premium Competent Cell中，涂布平板，37℃过夜培养，挑取单克隆，提取质粒PCR验证，重组阳性质粒经测序后命名为SD-IN1。

（2）片段In-PCR2的扩增克隆。cDNA产物2 μL，cDNA-2F和cDNA-2R（20 pmol/μL）各1 μL，Tks Gflex聚合酶进行PCR反应。反应条件94℃ 1 min；98℃ 10 s，52℃ 15 s，68℃ 3 min，共进行32个循环；4℃保存。将扩增得到的In-PCR2产物纯化后与经ClaⅠ酶切的上述SD-IN1质粒经In-Fusion HD体系进行连接、转化、验证，重组阳性质粒经测序命名为SD-IN2。

（3）全长cDNA的扩增克隆。cDNA产物2 μL，cDNA-3F和cDNA-3R（20 pmol/μL）各1 μL，Tks Gflex聚合酶进行PCR反应。反应条件94℃ 1 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，68℃ 2 min，共进行32个循环；4℃保存。扩增得到的In-PCR3产物与经ClaⅠ酶切的上述SD-IN2质粒进行连接、转化、克隆。

1.2.4 全长cDNA克隆的验证和序列分析 挑取单克隆，提取质粒，用两对引物IN-P1/P2和IN-F1/F2分别进行分段的PCR扩增验证，经测序的阳性克隆命名为SD-IN3，即全长cDNA克隆质粒。全长序列进行拼接后利用DNAStar v6.13进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 分段PCR扩增结果

按照预期设计，分三段进行NDV病毒全长cDNA的扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示，获得3个目的基因片段，其大小均与预期扩增大小相符，为4.0～5.8 kb（见图2）。

2.2 全基因组cDNA克隆的PCR验证

全长SD-IN3重组质粒用IN-P/F系列引物进行分段PCR扩增验证，获得2个基因片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示其大小均与预期相符，约5.0 kb（见图3）。

2.3 全基因组cDNA序列的测定与分析

通过对全基因组cDNA序列的测定与拼接，得到的SD毒株基因组总长度为15 192 bp，符合NDV的“六碱基”原则。利用DNAStar软件分析，发现6个开放阅读框的起始区高度保守，构建的cDNA序列与亲本毒的氨基酸序列一致性为99.9%。单个序列比对发现，全基因组cDNA克隆中有11处碱基突变，只有2处引起氨基酸序列发生改变；整个序列未出现基因的缺失、插入变化，因此全长氨基酸的数量亦未发生变化。构建的全基因组cDNA克隆可用于病毒的感染性拯救研究。

3 讨论与结论

本研究采用的In-Fusion HD克隆技术可以将PCR产物直接克隆到任意载体中，无需引物酶切位点的设计、限制性内切酶处理或粘性末端平滑化。In-Fusion酶可以利用线性化载体末端和PCR产物末端的15个相同的碱基，实现高效、精确的克隆，大大减少了筛选正确克隆的工作量，最终获得的克隆具有定向的插入片段且不含多余序列[9]。

NDV反向遗传操作技术体系主要包括基因组全长cDNA的克隆以及NP、P和L蛋白辅助质粒的构建及共转染到特定的细胞系中拯救病毒粒子和新生病毒特性的鉴定[7，10]。Peeters等采用表达T7 RNA聚合酶的重组禽痘病毒构建疫苗毒株La Sota的感染性分子克隆，对F0裂解位点进行改造，将F0裂解位点的氨基酸序列从GGRQOIL/L转变为GGRQORR/F时，病毒的毒力显著增强。这样直接证明F蛋白是决定NDV毒力的主要原因，NDV F0蛋白裂解位点的变化可以显著改变NDV的毒力，从而结束了对F蛋白和毒力关系的推测[11]。

近年来，应用反向遗传学技术拯救RNA病毒是RNA病毒学研究的一个热点。感染性克隆病毒通过基因的突变、缺失、替换等技术而产生基因改造的新病毒，这在病毒的生活周期、基因结构和功能、致病机理、新型疫苗构建和抗肿瘤作用等研究方面具有很好的应用前景。本研究成功构建了SD毒株全长cDNA的克隆，并且引入T7启动子序列，为后续的反向遗传平台的建立奠定基础。

参 考 文 献：

[1]Alexander D J. Newcastle disease[J]. British Poultry Science， 2001， 42（1）：5-22.

[2]Samour J. Newcastle disease in captive falcons in the Middle East： a review of clinical and pathologic findings[J]. Journal of Avian Medicine & Surgery， 2016， 28（1）：1-5.

[3]Liu X F， Wan H Q， Ni X X， et al. Pathotypical and genotypical characterization of strains of Newcastle disease virus， isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001[J]. Archives of Virology， 2003， 148（7）：1387-1403.

[4]Cheng J H， Sun Y J， Zhang F Q， et al. Newcastle disease virus NP and P proteins induce autophagy via the endoplasmic reticulum stress-related unfolded protein response[J]. Scientific Reports， 2016， 6：24721.

[5]Qiu X， Zhan Y， Meng C， et al. Identification and functional analysis of phosphorylation in Newcastle disease virus phosphoprotein[J]. Archives of Virology， 2016， 161（8）：2103-2116.

[6]Li B Y， Li X R， Lan X， et al. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA using an RNA polymerase Ⅱ promoter[J]. Archives of Virology， 2011， 156（6）：979-986.

[7]Liu Y L， Hu S L， Zhang Y M， et al. Generation of a velogenic Newcastle disease virus from cDNA and expression of the green fluorescent protein[J]. Archives of Virology， 2007， 152（7）：1241-1249.

[8]袁小遠， 杨金兴， 王友令，等. 一株野禽新城疫强毒分离株的分子特性及其对不同宿主的致病性[J]. 农业生物技术学报， 2014， 22（3）：273-279.

[9]Zhu B， Cai G， Hall E O， et al. In-fusion assembly： seamless engineering of multidomain fusion proteins， modular vectors， and mutations[J]. Biotechniques， 2007， 43（3）：354-359.

[10]Krishnamurthy S， Huang Z， Samal S K. Recovery of a virulent strain of Newcastle disease virus from cloned cDNA： expression of a foreign gene results in growth retardation and attenuation[J]. 2001， 278（1）：168-182.

[11]Peeters B P， de Leeuw O S， Koch G， et al. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA： evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence[J]. Journal of Virology， 1999， 73（6）：5001-5009.