基于AFLP标记的黄河三角洲中国柽柳种质资源遗传多样性分析

李永涛+杨庆山+刘德玺+周健+王莉莉+王振猛+魏文千

摘要：为了解黄河三角洲地区分布的中国柽柳单株间的遗传关系，利用AFLP 分子标记技术对黄河三角洲滨海地区天然分布的60个中国柽柳优良单株的遗传多样性进行了分析。结果表明，筛选出的8对引物组合在60个中国柽柳单株中共扩增出1 197个条带，其中多态性条带1 177个，平均每对引物扩增出149.63个条带和147.13个多态性条带，平均多态性条带比率为98.27%。每个位点的平均多态信息量为0.1648，平均有效等位基因数为1.2562，平均多样性指数为0.2718。60份材料间的遗传相似性系数介于0.8148～0.9172之间，经聚类分析，以遗传相似性系数0.86为阈值，可将60份种质资源聚为6个类群；其中，第6组群内再以遗传相似性系数0.872为阈值时，又可分为7个亚组。本研究揭示出黄河三角洲滨海地区中国柽柳单株间虽存在一定的遗传多样性，但遗传基础差异较小，可为该区域柽柳种质资源保存、鉴定和利用提供理论依据。

关键词：黄河三角洲；中国柽柳；AFLP；遗传多样性

中图分类号：Q781 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）07-0021-06

Abstract In order to understand the genetic relationship of Tamarix chinensis in the Yellow River Delta， the genetic diversity of 60 T. chinensis superior individuals was tested by AFLP technique. The results showed that 1 197 fragments were amplified by 8 selective primer pairs from 60 superior individuals of T. chinensis， and there were 1 177 polymorphic fragments. A total of 149.63 fragments and 147.13 polymorphic fragments were amplified for each pair of primers. The average polymorphism percentage was 98.27%. The average polymorphic information of each locus was 0.1648， the average number of effective alleles was 1.2562， and the average index of genetic diversity was 0.2718. The average genetic similarity coefficients ranged from 0.8148 to 0.9172. Through clustering analysis， the 60 samples were clustered into 6 groups when the genetic similarity coefficient of 0.86 was used as the threshold value. In which， when the genetic similarity coefficient was 0.872， the sixth group could be divided into 7 subgroups. In short， although there were certain genetic diversity among T. chinensis superior individuals in the Yellow River Delta， the genetic basis difference was narrow. The results could provide theoretical bases for germplasm conservation， identification and utilization of T. chinesis in this region.

Keywords The Yellow River Delta； Tamarix chinensis； AFLP； Genetic diversity

黃河三角洲滨海地区是中国北方典型的泥质海岸，地下水埋藏浅且矿化度高，海水易内侵，土壤盐渍化严重，生态系统脆弱。目前，分布于黄河三角洲沿海及滩涂地带的大面积柽柳群落是维持该地区生态环境的重要支柱，其在黄河三角洲的生态维护以及植物资源的种质保护上都具有极其重要的价值[1]。

柽柳（Tamarix chinensis）为柽柳科（Tamaricaceae）柽柳属（Tamarix Linn.）植物，又称中国柽柳、三春柳等，具有高抗盐、抗旱、耐水湿的生物学特性[2]。黄河三角洲地区目前有中国柽柳和甘蒙柽柳两种柽柳分布，甘蒙柽柳多为大面积分布，中国柽柳多为零星散生。与甘蒙柽柳相比，中国柽柳植株更为高大，绿化效果更佳。目前中国柽柳已成为黄河三角洲滨海重盐碱地区重要的生态修复物种，并在盐碱地绿化和植被修复中得到广泛应用[3]。国内外对柽柳属植物的研究较多，内容涉及遗传分类、资源分布、抗逆生理等各个方面[4-6]。近几年，研究者们对于将分子标记应用于柽柳种质资源研究进行了有益的探索。赵景奎等[7]利用RAPD分子标记技术，对分布于东营市内不同小区域柽柳天然群体的遗传多样性进行检测。蒋志敏等[8]利用ISSR分子标记，对来自黄河三角洲三个居群的90个柽柳个体的遗传多样性进行了对比分析，并深入探讨了居群结构和遗传分化格局的成因。叶春秀等[9]选用SSR分子标记技术对10份分布于新疆塔河流域上、中、下游的柽柳种质资源进行遗传多样性分析，并构建了每份种质的指纹图谱。目前，利用RAPD、SSR分子标记技术对柽柳天然群体进行遗传多样性的研究已有所报道，但利用AFLP技术分析中国柽柳的遗传多样性还未见相关报道。为深入了解黄河三角洲滨海地区中国柽柳的遗传结构，本研究以天然分布的60份中国柽柳优良单株为研究材料，利用AFLP分子标记对其进行遗传多样性分析，以期为黄河三角洲滨海地区柽柳种质资源的保存、鉴定和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为黄河三角洲滨海区域天然分布的中国柽柳优良乔化型单株60株，采集时分别标记其经纬度（表1）。群体间为避免采集到同一家系的个体，各采集单株至少相隔1 km。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 剪取每个单株当年新生鲜叶片，立即放入装有硅胶的密封袋中干燥保存，带回实验室置于-70℃冰箱保存备用。采用CTAB 法提取叶片总DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-20℃保存备用。

1.2.2 AFLP扩增及检测 从64对随机引物组合中筛选出扩增条带数量多、多态性好、清晰度高、分布均匀的8 对引物组合（表2）。采用PstⅠ和MseⅠ内切酶对DNA样品进行酶切，然后与PstⅠ和MseⅠ特定接头连接，通过PstⅠ和MseⅠ预扩增引物进行预扩增。预扩增体系为：酶切连接产物2 μL，PstⅠ和MseⅠ预扩增引物各0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18.5 μL，共计25 μL体系；预扩增PCR条件为：94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 80 s，循环30次；再72℃延伸5 min，反应终止于4℃。将预扩增产物稀释20倍后，采用PstⅠ和MseⅠ引物组合进行选择性扩增，扩增体系为：预扩稀释样品2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，PstⅠ引物1 μL，MseⅠ引物1 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，共计25 μL体系；选择性扩增条件为：94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 80 s，1个循环；然后以每循环复性温度逐级降低0.7℃的梯度继续12个循环；接着按94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 80 s，扩增23轮；最后再72℃延伸5 min，反应终止于4℃。

PCR扩增在Gene Amp PCR System 9600扩增仪上完成，内切酶和T4连接酶均购自New England Biolabs公司，接头及引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。扩增产物变性后在4%聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳分离，染色显影。

1.3 数据处理与分析

在电泳图谱上对迁移率相同的条带进行统计，有带记为1，无带记为0。采用POPGENE version 1.32软件计算多态性条带比率（PPB）、多态信息量（PIC）、有效等位基因数（Ne）、多态性信息指数（PIC） 和多样性指数（I）等遗传多样性指标；利用NTSYSpc-V.2.1计算遗传相似性系数；根据相似性系数进行UPGMA聚类分析[10]。

2 结果与分析

2.1 AFLP 扩增结果

利用筛选出的8对多态性较高的引物组合对60份中国柽柳材料进行AFLP扩增，图谱（图1）显示扩增多态性好，所得扩增产物条带清晰，易于分辨。其中，扩增位点数最多的是引物P-GAG/ M-CTG组合，最少的是引物P-GAG/M-CTT组合（表3）。扩增片段大小主要在70～500 bp之间，8对引物在60份材料中共获得1 197个条带，其中多态性条带1 177个；不同引物对扩增的多态带比例均较高，变化范围为96.00%～99.43%，差异较小；其中引物对P-GAG/M-CTG扩增的多态带比例最高，为99.43%，而P-GTG/M-CTG扩增的多态带比例最低，为96.00%，平均多态性条带比率为98.27%。每个位点的平均多态信息量为0.1648，平均有效等位基因数为1.2562，平均多样性指数为0.2718。由此可见，选取的引物在柽柳优良单株间表现出较高的多态性水平，说明AFLP标记适合进行柽柳遗传多样性统计分析。

2.2 遗传相似性分析

遗传相似性系数是表示不同个体之间遗传差异大小的重要指标，60个中国柽柳单株的遗传相似性系数，在0.8148～0.9172之间，平均为0.8437。遗传相似性系数最小的是DY-18和XS-6，为0.8148，说明二者的亲缘关系最远，差异性最大；遗传相似性系数最大的是XS-29和XS-30，达到0.9172，说明二者的亲缘关系最近，遗传差异性最小。总之，通过遗传相似性分析，60个中国柽柳单株间均呈现出较近的亲缘关系，这可能与材料地域性有重要关系。

2.3 聚类分析

基于遗传相似性系数，通过UPGMA 法对60个中国柽柳单株进行聚类分析。由图2可以直观地看出不同单株间的遗传关系，在以相似性系数0.86为阈值进行切割时，60个柽柳单株可划分为6组。第1组包括2个单株，分别为XS-6和XS-7；第2组包括XS-10、XS-11、XS-14、XS-17、XS-23共5个单株；第3组包括1个单株为XS-31；第4组包括2个单株，分别为XS-5和XS-22；第5组包括1个单株为XS-15；第6组包括49个单株。在以遗传相似性系数0.872为阈值进行切割时，还可将第6组分为7个亚组，其中第1亚组包括XS-18、XS-21共2个单株；第2亚组、第3亞组和第4亚组均各包含1个单株，分别为XS-32、DY-26和 DY-22；第5亚组包括DY-1～DY-21、DY-23～DY-25、XC-35～XC-38共28个单株；第6亚组包括XS-4、XS-8、XS-12、XS-13、XS-16、XS-19、XS-20 和XS-24～XS-30共14个单株；第7亚组包括XS-3、XS-9共2个单株。聚类结果表明，大部分种质亲缘关系较近，遗传组成相似，种质间存在较多的基因交流。对应聚类分析结果和材料分布位置，60个柽柳单株的分组与其分布位置不完全一致。

3 讨论与结论

遗传多样性是物种基因丰富度的直接反映，而分子标记技术可快速检测遗传变异水平的高低。研究表明，AFLP是研究遗传多样性非常有效的分子标记技术[11]。本研究利用AFLP技术分析了60个中国柽柳单株，检测出大量的多态性位点，每对引物组合在不同的材料间也检测出共同的位点，表明AFLP 分子标记可用于中国柽柳单株的鉴定。Vogel等[12]认为当今世界上四大标记系统的综合效用大小比较关系为AFLP>SSR>RAPD>RFLP。赵景奎等[7]采用随机扩增多态DNA （RAPD）分子标记技术分析了黄河三角洲柽柳3个天然群体的遗传多样性，多态谱带比率为40.07%。叶春秀等[9]选用SSR分子标记技术对新疆塔河流域的柽柳种质资源进行遗传多样性分析，得出多态性比率为79.49%。本研究采用8对AFLP引物即可以将60份柽柳种质资源区分开来，供试的60个中国柽柳单株的多态性条带百分率平均值达到了98.27%，表明AFLP标记在植物种质鉴定和遗传多样性分析中具有重要意义，这与Vogel等[12]的研究完全一致。

通常情况下，AFLP电泳图谱上的每一条扩增条带都对应1个基因位点，出现多态性条带也就意味着某个或某些物种在该位点上存在变异[13，14]，如果多态性条带百分率超过50%，就可以认为该物种有较为丰富的遗传多样性[15]。而本研究中平均多态性条带比率达到了98.27%，表明该区域柽柳具有较高的遗传多样性。根据AFLP 标记及聚类分析结果，60个中国柽柳单株间的遗传相似性系数在0.8148～0.9172之间，平均为0.8437。其中，遗传相似性系数最高的是XS-29 和XS-30。通过地理坐标分析，两者直线距离为1.16 km，距离最近，说明地理距离一定程度上决定了种质间的遗传相似性；但聚类分析将柽柳种质分成的6组中，其中部分地理距离较近的单株并未严格地聚在一组，说明基于AFLP分子标记获得的60个中国柽柳单株间的遗传关系与其地理距离没有严格的相关性。

柽柳是黄河三角洲非常典型的适生植被，对土壤含盐量和土壤水分的忍耐能力直接决定其适应生境的能力。而适宜的生境使柽柳遭受的环境选择压力较小，保留了较大的群体数量。同时隔离障碍少，有利于基因流动，丰富了各群体内的基因资源[16]。本研究中60个柽柳单株间亲缘关系较近，遗传差异较小，可能个体彼此之间有许多相互连接的邻里，由于基因频率在邻里间进行交流，邻里间的基因频率差异小，导致各单株间在地理位置和遗传距离之间有一定关系。需要指出的是，本研究对柽柳种质资源的取材不够全面，所有取材集中于黄河三角洲滨海区域，范围小，不利于全面综合分析柽柳的遗传多样性，今后有待于扩大取材范围进行更深入的研究。

参 考 文 献：

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