同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱技术分析人血浆中利奈唑胺的浓度Δ

王晓雪，车仙花，崔 刚，张相林#

(1.卫生部中日友好医院药学部，北京 100029； 2.延边大学附属医院药学部，吉林 延吉 133000)

同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱技术分析人血浆中利奈唑胺的浓度Δ

王晓雪1*，车仙花2，崔 刚1，张相林1#

(1.卫生部中日友好医院药学部，北京 100029； 2.延边大学附属医院药学部，吉林 延吉 133000)

目的：建立超高效液相色谱-串联质谱法和同位素稀释内标法分析人血浆中利奈唑胺浓度的方法。方法：血浆样本经乙腈稀释沉淀蛋白进行前处理，以同位素利奈唑胺-d3为内标，采用Acquity UPLC©BEH-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)分离，流动相包括水(含0.1%甲酸，V/V)和乙腈(含0.1%甲酸，V/V)，梯度洗脱，流速为0.3 ml/min。正离子检测模式下，采用多离子反应监测模式进行分析。结果：利奈唑胺浓度在0.078～10.000 μg/ml范围内线性关系良好，定量限为0.078 μg/ml；日内、日间RSD均<6%；提取回收率>90%。结论：本方法操作简便、快速、准确、专属性强且稳定性良好，适用于人血浆中利奈唑胺浓度的分析，可用于临床治疗药物监测。

利奈唑胺； 超高效液相色谱-串联质谱法； 同位素稀释内标法

利奈唑胺是首个人工合成应用于临床的新型唑烷酮类抗菌药物，通过抑制细菌蛋白质合成的最早阶段达到杀菌效果，与其他药物不存在交叉耐药[1-2]。该药主要用于治疗耐万古霉素屎肠球菌引起的感染、耐甲氧西林金黄葡萄球菌引起的院内获得性肺炎、耐多药肺炎链球菌引起的社区获得性肺炎等，是抗革兰阳性菌感染的最后一道防线，但其在肾功能不全患者 体内血药浓度较高，会引起血小板减少症等不良反应[3-7]。因此，有必要建立准确、快速、稳定的体内利奈唑胺分析方法，实时监测重症患者的血药浓度，及时调整给药剂量，保证用药安全、有效。本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)和同位素稀释内标法分析人血浆中利奈唑胺浓度的方法，现报告如下。

1 材料

1.1 仪器

Acquity超高效液相色谱仪、Quattro Premier XE型三重四级杆质谱仪、电喷雾离子化源(ESI)及Masslynx 4.1数据处理系统均购自美国Waters公司；Milli-Q Advantage A10型超纯水机(美国Millipore公司生产)。

1.2 药品与试剂

利奈唑胺对照品(批号：1-MLM-3-1)、利奈唑胺-d3对照品(批号：1-HTW-54-1)均购自加拿大Toronto Research Chemicals INC；甲酸(德国CNW公司)、乙腈(美国Fisher Scientific公司)均为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件：色谱柱为Acquity UPLC©BEH-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相A为水(含0.1%甲酸，V/V)，流动相B为乙腈(含0.1%甲酸，V/V)；柱温为40 ℃；流速为0.3 ml/min；梯度洗脱条件见表1；进样量为2 μl。

表1 梯度洗脱条件

2.1.2 质谱条件：正离子检测模式(+ESI)；毛细管电压为3.5 kV；锥孔电压为35 V；锥孔温度为120 ℃；离子源温度为400 ℃；脱溶剂气(N2)流速为800 L/h；锥孔反吹气流速为50 L/h；采用多离子反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)扫描方式；监测离子对，利奈唑胺 [M+H]+m/z338.1→296.1；利奈唑胺-d3 [M+H]+m/z341.0→297.0。

2.2 标准品储备液的制备

准确称取利奈唑胺5 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，获得质量浓度为500 μg/ml的储备液，于4 ℃冷藏保存。

2.3 内标溶液的制备

准确称取利奈唑胺-d3 1 mg，加入适量甲醇，反复多次溶解转移至10 ml容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度。从中取250 μl置于10 ml容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度。最终获得质量浓度为2.5 μg/ml的内标溶液。分装成若干份，于4 ℃冷藏保存。

2.4 标准曲线和质量控制(quality control，QC)样品的制备

吸取空白血浆980 μl置于1.5 ml离心管中，精密加入标准品储备液20 μl，用空白血浆进行等比稀释，分别配制成质量浓度为10.000 0、5.000 0、2.500 0、1.250 0、0.625 0、0.312 5、0.078 0 μg/ml的系列溶液作为标准曲线点。另取空白血浆适量，加入标准品储备液，分别配制成质量浓度为0.37、1.11、3.33 μg/ml的低、中、高3个QC样品。

2.5 血浆样本前处理

精密吸取血浆样品50 μl，加入内标液(利奈唑胺-d3 2.5 μg/ml)20 μl，加入乙腈550 μl，涡旋5 min(转速12 000 r/min)，离心10 min(转速12 000 r/min)，取上清液500 μl加入样品瓶。

2.6 质谱分析

采用正离子检测方式，对利奈唑胺和利奈唑胺-d3进行一级质谱扫描，发现两者的准分子离子峰[M+H]+分别为m/z338.1及341.0；通过二级质谱扫描及碰撞能优化，发现在碰撞电压为24 eV时，可以获得丰度较高的子离子，分别为m/z296.1及297.0，见图1。故选择离子对338.1～296.1及341.0～297.0进行MRM定量分析。

2.7 方法专属性考察

空白血浆和含标准品空白血浆(利奈唑胺)，均按照“2.5”项下方法处理后进样分析。结果表明，血浆中的内源性物质不干扰利奈唑胺及利奈唑胺-d3的测定，利奈唑胺保留时间为0.6 min，见图2。

2.8 标准曲线和定量限

将“2.4”项下制备的标准曲线点，按“2.5”项下方法处理后进样检测，线性回归建立标准曲线。利奈唑胺采用内标法定量，共用内标利奈唑胺-d3。结果表明，利奈唑胺质量浓度在0.078～10.000 μg/ml范围内线性关系良好，其线性回归方程为Y=0.335X+0.000 9(Y为利奈唑胺质量浓度，X为利奈唑胺峰面积/内标峰面积)，相关系数r2≥0.993 5；定量限可达到0.078 μg/ml。

A.利奈唑胺([M+H]+ m/z 338.1)；B.利奈唑胺-d3(内标)([M+H]+ m/z 341.0)A.linezolid([M+H]+ m/z 338.1)；B.linezolid-d3(internal control)([M+H]+ m/z 341.0)图1 MS/MS图Fig 1 MS/MS chromatography

A.空白血浆；B.空白血浆加入利奈唑胺；C.空白血浆加入利奈唑胺-d3(内标)A.blank plasma；B.blank plasma with linezolid；C.blank plasma with linezolid-d3(internal control)图2 UPLC图图2 UPLC chromatography

2.9 准确度和精密度试验

取利奈唑胺低、中、高3个质量浓度(分别为0.37、1.11、3.33 μg/ml)的QC样品，按“2.4”项下方法操作，每个质量浓度进行5份样品分析，连续测定3 d，计算批内和批间变异。结果表明，该方法的准确度和精密度符合要求，见表2。

表2 利奈唑胺测定方法的准确度、精密度试验结果Tab 2 Accuracy, precision test results of determination method of linezolid

2.10 基质效应和提取回收率试验

2.10.2 提取回收率：A.配制低、中、高3个质量浓度的含药血浆50 μl，按“2.5”项下方法处理，每个质量浓度平行5份，进样检测；B.另取空白血浆50 μl按“2.5”项下方法进行处理，不加内标，向获得的上清液中加入内标液及适量的低、中、高质量浓度标准品溶液，配制成与“A”中相同质量浓度的QC样品，每个质量浓度平行5份，进样检测。计算方法为提取回收率=A峰面积/B峰面积×100%。结果显示，低、中、高3个质量浓度的QC样品具有较高的提取回收率，均>90%(见表3)，可满足生物样本分析要求。

表3 利奈唑胺测定方法的基质效应和提取回收率试验结果Tab 3 Matrix effects and recovery test of determination method of linezolid

2.11 稳定性试验

制备4组利奈唑胺含药血浆，每组包括低、中、高3个质量浓度各5份，分别考察反复冻融3次、-80 ℃冻存15 d、-20 ℃冻存7 d、4 ℃保存2 d对利奈唑胺稳定性的影响，结果显示，上述含药血浆均稳定(RSD<4.0%)；制备2组标准品储备液和内标溶液各5份，分别考察反复冻融2次、-80 ℃冻存90 d对利奈唑胺稳定性的影响，结果显示，上述溶液均稳定(RSD<3.8%)。

3 讨论

目前，国内外监测利奈唑胺血药浓度的文献报道有限[8-10]，国内尚未见利用同位素稀释内标法进行体内含量分析的研究。

本实验建立了基于UPLC-MS/MS分析人血浆中利奈唑胺的方法。在前处理方法的考察上，比较了乙腈和乙腈(含0.1%甲酸，V/V)2种溶剂，发现流速为0.2 ml/min时，采用乙腈进行前处理的利奈唑胺血浆浓度比采用后者进行处理的低10%；流速为0.3 ml/min时，两者无明显区别。故采用乙腈直接沉淀蛋白进行样本前处理。该方法操作简便、提高了工作效率。

合适的内标应与待测物具有相近的保留时间、相似的提取回收率及基质效应，以提高分析方法的准确度和精密度。本实验采用利奈唑胺的氘代同位素利奈唑胺-d3作为内标，其与原药具有相同的色谱保留时间、相似的提取回收率和离子化效率，可以最大程度减少基质效应的干扰，提高了生物样本中利奈唑胺质量浓度测定的准确度。

在色谱条件优化方面，考察了乙腈-水(含0.1%甲酸，V/V)、甲醇-水(含0.1%甲酸，V/V)、乙腈-水等流动相系统。在正离子检测模式下，向水相中加入甲酸，可提高化合物的离子化效率，提高检测灵敏度，并改善峰形。实验结果显示，采用乙腈-水(含0.1%甲酸，V/V)为流动相进行梯度洗脱时，可获得对称的峰形、良好的分离度及较快的分析速度(3 min)。质谱优化实验结果显示，利奈唑胺-d3的[M+H]+m/z341.0比利奈唑胺的[M+H]+m/z338.0多3 amu；而前者的子离子m/z297.0，仅比后者的子离子m/z296.0多1 amu。由此推断，另外2个氘原子的取代位置在中性丢失碎片上，子离子m/z296.0及m/z297.0的结构一致，可以用于定量分析。

综上所述，本研究采用利奈唑胺的同位素做内标，建立了基于UPLC-MS/MS技术的人血浆中利奈唑胺定量分析方法。该方法准确、快速、稳定、可靠，适用于临床治疗药物监测。

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Analysis on Content of Linezolid in Human Plasma by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry with Isotopes DilutionΔ

WANG Xiaoxue1, CHE Xianhua2, CUI Gang1, ZHANG Xianglin1

(1.Dept.of Pharmacy, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China; 2.Dept.of Pharmacy, Affiliated Hospital of Yanbian University, Jilin Yanji 133000, China)

OBJECTIVE：To establish a method for analysis of content of linezolid in human plasma by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with isotopes dilution. METHODS: Plasma samples were disposed by acetonitrile dilution protein deposition, isotope rina thiazole amine-d3 was set as internal control, and Acquity UPLC©BEH-C18column(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)was adopted, the mobile phase consisted of water(0.1% formic acid,V/V)and acetonitrile(0.1% formic acid,V/V)in gradient elution, at flow rate of 0.3 ml/min. Under positive ion detection mode, multiple ion reaction monitoring mode was adopted for analysis. RESULTS: The content of linezolid showed good linear relationship within 0.078 μg/ml-10.000 μg/ml, the limit of quantitation was 0.078 μg/ml. AndRSDof intra- and inter-day precision <6%, the recovery >90%. CONCLUSIONS: This method is simple, rapid and accurate with strong specificity and good stability, which can be used for analysis of content of linezolid in human plasma and clinical therapeutic drug monitoring.

Linezolid; Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Isotopes dilution

国家自然科学青年基金(No.81503175)；中日友好医院青年基金(No.2014-3-QN-27)

R917

A

1672-2124(2017)05-0581-04

2017-02-28)

*主管药师，博士。研究方向：基于质谱技术的药物及代谢物分析、治疗药物监测。E-mail：67671218@qq.com

#通信作者：主任药师，副教授，硕士生导师。研究方向：个体化给药与临床药理学。E-mail：zryhyyzxl@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.05.002