赤水晒醋一株产气微生物的分离鉴定

白成松，卢红梅，杨新，任勰珂，安家静，陈莉*

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025）

赤水晒醋一株产气微生物的分离鉴定

白成松1，卢红梅2，杨新2，任勰珂2，安家静2，陈莉1*

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025）

为了解赤水晒醋产气原因，采用多种培养基分离和计数产气微生物，并检测其生理生化特征，生长特性以及16S rDNA基因序列分析。实验结果表明，从变质晒醋中分离到一株产气微生物，编号为N9，革兰氏阳性，有芽孢，最适生长温度为45℃，最适生长pH值为5.5，最适生长盐度（氯化钠含量）为1%，繁殖能力强。经过16S rDNA基因序列以及系统发育树分析可以鉴定该菌为产碱普罗威登斯菌（Providencia alcalifaciens）。

赤水晒醋；产气微生物；分离鉴定；特性研究

食醋是一种酸味调味剂，深受人们的喜爱，根据研究表明食醋具有抗菌杀菌、增强免疫力、预防骨质疏松等功能[1-2]。食醋按生产方法的不同有酿造食醋和人工合成食醋。赤水晒醋作为传统酿造食醋中的一种，独具特色。赤水晒醋采用固态发酵繁殖产生天然醋酸菌，醋坯和成品醋均经日光暴晒，因此而得名“晒醋”。原料以麸皮为主，百余种名贵中草药配方制作醋曲；优质大米、糯米的精选、蒸煮；麦麸、小麦及醋曲与大米粥拌醅；醋醅室内发酵；醋醅装坛；日光曝晒；醋醅浸淋；产品精酿；灭菌等三十六道工序。整个生产周期要经过两、三年以上才能成形。晒醋具有香、酸、醇、浓等特点，色呈红棕色，味酸柔和，稍有甜口，不涩口，不霉变，香气浓郁。虽然赤水晒醋的酸度达到6°T，不需要添加其他防腐剂，但由于赤水晒醋是传统酿造食醋，受天时地利、人工操作的影响很大，仅依赖高酸度，其安全性并非绝对能得到保障[3]。

2015年上半年，某晒醋公司的食醋出现严重的产气现象明显，导致食醋胀袋、胀瓶，甚至爆瓶，这不仅影响了晒醋在消费者中的形象，还给公司带来了严重的经济损失。近年来，国内已有关于酿造食醋出现产气现象的相关的研究，张怀敏等[4]研究了导致山西老陈醋胀袋的原因，其研究结果显示，导致老陈醋产气的主要原因是产气芽孢杆菌。郑宇等[5]比较分析了正常食醋和胀气食醋样品的理化指标和活菌数的差异，并分析了胀气食醋样品中主要的气体成分，分离鉴定了食醋中潜在的污染微生物。本研究从赤水产气晒醋中分离一株产气的微生物，进行分子生物学鉴定，并研究其生长特性，为防治赤水晒醋产气提供重要的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤水食醋样品：某晒醋公司提供产气食醋（问题食醋）和正常食醋；碘化钾、碘（均为分析纯）：贵州赛兰博科学仪器有限公司；无水乙醇、体积分数为95%乙醇（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；氯化钠（分析纯）：成都临江化工厂；刚果红：天津市科密欧化学试剂有限公司；脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside，dNTP）、Taq DNA聚合酶、MgCl2：上海生工生物工程公司。

平板计数琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红培养基、改良高氏一号、麦芽浸粉肉汤培养基：北京陆桥技术股份有限公司；乳酸细菌培养基：英国Oxoid公司；LB液体培养基（pH3.5）：按相关文献进行配制。

1.2 仪器与设备

DMS-653广西生物数码显微镜：深圳市博宇仪器有限公司；∑IGMA电子扫描显微镜：北京普瑞赛司仪器有限公司；SPX-250B智能型生化培养箱、DHG-9140B（101-2B）智能型电热恒温鼓风干燥箱：上海琅玕实验设备有限公司；YXQ-LS-5DS11立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；NDJ-1旋转粘度计：上海天平仪器厂；SITA-t15动态表面张力仪：桂宁（上海）实验器材有限公司；752N紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；5531型PCR扩增仪：上海珂淮仪器有限公司；DYY-2C双稳定时电泳仪：上海六一生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 微生物的分离、纯化

无菌条件下吸取混匀的问题食醋0.2 mL，分别加入装有不同培养基（平板计数琼脂/马铃薯葡萄糖琼脂/孟加拉红/改良高氏一号/麦芽浸粉肉汤/乳酸细菌培养基）的培养皿中，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布均匀，再用无菌膜封培养皿，然后分别倒置于普通恒温培养箱和厌氧培养箱中培养3～5d，培养温度30℃。同时以正常食醋作为对照。食醋中微生物菌落总数、大肠菌群的测定分别参照国标GB 4789.2—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》和GB 4789.38—2012《食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》中的方法执行[6-7]。

将分离到的微生物用相应的固体培养基进行划线分离纯化，传代3次。并用相应的斜面培养基在4℃条件下保存备用。保存的菌株每个月转接1次。

1.3.2 产气和黏度检测实验

配制LB培养基，调节pH至3.5，分装到试管中，并加入杜氏小管，然后进行121℃、20min湿热灭菌。选择正常的赤水晒醋，分装到试管中，并加入杜氏小管，然后进行121℃、20 min湿热灭菌。

将分离出的微生物接种到上述培养基和正常的赤水晒醋中，30℃培养3～5 d，观察小导管中是否有气泡以及检测培养基的黏度变化[8-9]。同时，以不接种作为对照。

1.3.3 微生物形态观察以及生理生化测定

将分离出来的主要微生物进行菌落形态观察（形态、颜色、边缘、透明度等特征）以及个体形态观察（染色显微镜观察）。按文献《伯杰细菌鉴定手册》[10]和《常见细菌鉴定手册》[11]分别对获得的微生物进行生理生化实验。

1.3.4 16S rDNA基因序列分析

微生物总DNA的提取：利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取实验菌株的DNA，其具体步骤参见试剂盒的说明书。DNA提取产物保存于-20℃冰箱中。

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增16S rDNA：以提取的基因组DNA为模板，利用通用引物正向引物27F和反向引物1492R进行PCR扩增。通用引物ITS1和ITS4被用于rDNA ITS区段的PCR扩增。它们的序列是：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反应在标准反应体系中完成。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃变性50 s，56℃复性50s，72℃延伸90s，30个循环；最后于72℃延伸10min。采用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测。

DNA测序：纯化后的目的基因送上海生工公司进行测序。测序结果用Chromas软件参照正反序列图谱进行人工校正。

系统发育树的构建：用BLAST将测序结果在美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中与已知细菌的16S rDNA基因序列进行同源性分析，并用MEGA5.10软件的邻接法（neighborjoining，N-J）法构建系统发育树，具体确定菌株的种属。

1.3.5 微生物生长特性研究[12-15]

活化菌种：将分离的主要的菌株接种在装液量为100mL/ 250mLLB液体培养基中，在30℃条件下培养24 h。

培养温度的影响：接入10%活化菌株于装液量为100mL/ 250mLLB液体培养基中，分别置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃条件下，静置培养24 h，摇匀后测定各菌液的OD600nm值，并绘制温度对菌株生长影响的曲线。

盐度对微生物生长的影响：分别配制含有0、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%NaCl的LB液体培养基，然后进行121℃、20min湿热灭菌。再接入10%的活化菌种，静置培养24 h，摇匀后测定各菌液的OD600nm值，并绘制盐度对菌株生长影响的曲线。

pH对微生物生长的影响：配制LB培养基，分装于250mL的三角瓶中，并调节pH值至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5，然后进行121℃、20 min湿热灭菌，以灭菌后实际测得的pH为准。然后接入10%活化菌种，静置培养24 h，摇匀后测定各菌液的OD600nm值，并绘制pH对菌株生长影响的曲线。

微生物生长曲线绘制：将活化的菌种接种到LB培养基最适生长盐度、最适生长pH中，置于其最适生长温度下，静置培养，培养前的16 h，每隔4 h测量1次OD600nm值，培养16 h后，每隔8 h测1次OD600nm值，连续测5 d。

2 结果与分析

2.1 问题食醋中产气微生物形态学观察

采用不同培养基（平板计数琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、孟加拉红、改良高氏一号、麦芽浸粉肉汤、乳酸细菌培养基）在好氧和厌氧条件下培养变质食醋。研究发现，只有用平板计数琼脂培养基在厌氧条件下才长出微生物，并且数量不多，其他的培养基无论是在好氧还是厌氧条件下都不能长出微生物。分离出的微生物经过产气和黏稠增加实验，得到主要的1株微生物，编号为N9，其在LB液体培养基中产气明显，在正常的赤水晒醋中产气缓慢，菌株N9菌落形态及电镜图见图1。

由图1（A）可知，菌株N9菌落呈黄色，表面湿润光滑，边缘整齐，易挑起，透明；菌株N11菌落呈浅黄色，表面湿润光滑，边缘不整齐，易挑起，不透明。由图1（B）可知，该株菌为杆状，长约1.423 6 μm，直径约0.694 4 μm。

2.2 菌株N9生理生化测定结果

按文献《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》对菌株N9进行生理生化测定，测定结果见表1。

2.3 菌株N9分子生物学鉴定

采用16S rDNA测序方法对菌株N9进行分子生物学鉴定，对DNA进行序列扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将所得测序结果输入NCBI进行BLAST对比，采用N-J法构建系统发育树，结果见图2。

图2 菌株N9基于16S rDNA基因序列建立的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain N9 based on 16S rDNA sequence

由图2可知，菌株N9的16S rDNA基因序列比对结果与为产碱普罗威登斯菌（Providencia alcalifaciens）相似度为98%，与Providencia alcalifaciens最为接近。结合菌株N9的细胞形态、菌落形态、生理生化特征，可以鉴定菌株N9为产碱普罗威登斯菌（Providencia alcalifaciens）。

2.4 菌株N9生长特性的研究

2.4.1 培养温度对菌株N9生长的影响

图3 培养温度对菌株N9生长的影响Fig.3 Effects of culture temperature on the growth of strain N9

由图3可知，菌株N9在培养温度30～40℃范围内，OD600nm值上升比较缓慢；在培养温度40～45℃范围内，OD600nm值上升较快；在培养温度45℃时，OD600nm值达到最大值；培养温度＞45℃之后，OD600nm值先快速下降，再缓慢下降，最后OD600nm值接近为0。因此，菌株N9的最适生长温度为45℃。2.4.2 pH对菌株N9生长的影响

由图4可知，菌株N9在pH 2.5～5.5，OD600nm值逐渐增加；菌株N9在pH值为5.5时，OD600nm值达到最大值；菌株N9在pH＞5.5之后，OD600nm值快速的下降。因此，菌株N9最适生长pH值为5.5。

图4pH对菌株N9生长的影响Fig.4 Effects of pH on the growth of strain N9

2.4.3 盐度对菌株N9生长的影响

图5 盐度对菌株N9生长的影响Fig.5 Effects of salinity on the growth of strain N9

由图5可知，菌株N9在盐度为0～1%时，OD600nm值逐渐增加；菌株N9在盐度为1%时，OD600nm值达到最大值；菌株N9在盐度＞1%之后，OD600nm值逐渐下降。因此，菌株N9的最适生长盐度为1%。

2.4.4 菌株N9生长曲线

图6 菌株N9的生长曲线Fig.6 Growth curves of strain N9

由图6可知，在0～16 h之间，菌株N9处于对数生长期，菌体快速繁殖，OD600nm值变化最大，随后由于营养物质的大量消耗，在16～24 h之间，菌株N9生长开始变缓，24～64 h之间菌株N9进入稳定期，细菌数目和代谢产物达到最高水平，菌体OD600nm值较稳定，64 h后菌株N9进入衰亡期，菌体开始死亡，OD600nm值开始下降，从OD600nm值变化趋势来看，菌株N9具有较快的生长速度，对数期开始比较早。

3 结论

通过用不同培养基在好氧和厌氧条件下培养变质食醋，结果发现，只有用平板计数琼脂在厌氧条件下才长出微生物，并且数量不多，其他的培养基无论是在好氧还是厌氧条件下微生物都不生长。分离出的微生物经过产气验证实验，得到主要的一株产气微生物。通过检测其生理生化特征，以及16S rDNA基因序列分析，鉴定出该菌为产碱普罗威登斯菌（Providencia alcalifaciens）。通过对该株菌做生长特性实验得知，该株菌的最适生长温度为45℃，最适生长pH为5.5，最适生长盐度为1%，具有较快的生长速度，对数期开始比较早。充分了解菌株N9的生长特性，为防治晒醋产气提供一定的理论基础。

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Isolation and identification of a gas-producing bacterium from Chishui sun vinegar

BAI Chengsong1,LU Hongmei2,YANG Xin2,REN Xieke2,AN Jiajing2,CHEN Li1*
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy,Guiyang 550025,China)

In order to figure out the aerogenesis reason of Chishui sun vinegar,using a variety of culture mediums to isolate and count gas-producing microorganism,and the physiological-biochemical characteristics of strains were detected and 16S rDNA gene sequence were analyzed.The results showed that one gram-positive bacterium with spore,coded as N9,was isolated from the samples of Chishui sun vinegar.The optimum growth temperature of the strain was 45℃,pH was 5.5 and the optimum growth salinity(NaCl content)was 1%.The strain had strong reproduction ability. Through the analysis of 16S rDNA gene sequences and phylogenetic tree analysis,the strain N9 was identified asProvidencia alcalifaciens.

Chishui sun vinegar;gas-producing microorganisms;isolation and identification;characteristic research

TS264.2

0254-5071（2017）06-0072-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.015

2017-04-07

贵州大学研究生创新基金（2016055）

白成松（1991-），男，硕士研究生，研究方向发酵工程。

*通讯作者：陈莉（1981-），女，副教授，硕士，研究方向应用微生物。