万学东 王 博 陈群力 李三强 席守民
(河南科技大学医学院生物化学与分子生物学教研室,河南 洛阳 471003)
褪黑素对软脂酸诱导L02细胞胰岛素抵抗的防护作用及机制
万学东 王 博1陈群力 李三强 席守民
(河南科技大学医学院生物化学与分子生物学教研室,河南 洛阳 471003)
目的 探讨褪黑素(MT)对软脂酸(PA)诱导L02细胞胰岛素抵抗的防护作用及机制。方法 培养L02细胞,分别设立对照组(BSA组)、PA组、PA+MT组、PA+维生素C(VitC)组。各组药物浓度和孵育时间根据不同的实验需要来确定。用荧光比色法测定各组细胞胞内氧自由基(ROS)水平,Western印迹法检测胰岛素刺激后胞内胰岛素信号蛋白磷酸化水平,包括Y-p-胰岛素受体(IR)、Y-p-胰岛素受体底物(IRS)1/2以及应激敏感激酶p-JNK水平。结果 用不同浓度的PA处理L02细胞24 h,细胞内ROS生成量呈现明显的浓度依赖关系,差异有统计学意义(P<0.05);用0.3 mmol/L的PA处理L02细胞不同时间,细胞内ROS生成量存在明显的时间依赖关系,在24 h达到最高,并在36 h后仍维持较高水平(P<0.05);与BSA组相比,PA组ROS含量明显升高(P<0.05)PA+MT组ROS含量无明显变化(P>0.05);PA+MT组ROS生成量明显低于PA组(P<0.05)。PA+VitC组与PA组相比,ROS的生成量减少,但仍高于PA+MT组(P<0.05)。与BSA组相比,PA组Y-p-IR、Y-p-IRS1/2磷酸化水平减少,而p-JNK磷酸化水平升高;与PA组相比,PA+MT组Y-p-IR、Y-p-IRS1/2磷酸化水平显著升高,p-JNK磷酸化水平明显降低(P<0.05)。结论 PA导致细胞内ROS增加,MT能够清除PA产生的过量ROS。MT通过减少JNK的活化,改善因ROS引起的胰岛素信号传递损伤,对PA诱导的胰岛素抵抗具有防护作用。
胰岛素抵抗;活性氧ROS;褪黑素;胰岛素受体;胰岛素受体底物1/2;c-Jun 氨基末端激酶JNK
胰岛素抵抗是2型糖尿病(T2DM)的基本病理生理现象之一,并贯穿其发生发展的始终。血清游离脂肪酸(FFA)水平升高,在胰岛素抵抗早期已经发挥作用,是导致胰岛素抵抗的重要的危险因素之一,也是糖尿病脂毒学说的重要内容〔1〕。氧化应激作为一种重要的病理生理过程,参与了胰岛素抵抗的形成,同时也是糖尿病各种慢性并发症的共同基础〔2〕。褪黑素(MT)是由松果体分泌的一种神经激素,可以通过各种膜结构进入细胞发挥强大的抗氧化、抗自由基功能〔3〕。本研究观察并分析MT对人胚胎干细胞L02细胞形成胰岛素抵抗的防护作用及机制。
1.1 药物与试剂 PA、MT、2',7'-二氯氢化荧光素二酯(DCFH-DA)、无血清白蛋白(BSA)等购自Sigma公司(USA);胎牛血清(浙江三利公司);RPMI-1640培养基(Gibco,USA);磷酸化JNK(Thr183/Tyr185)和β-actin鼠多克隆抗体、磷酸化胰岛素受体(IR)(Tyr1162/1163)兔多克隆抗体、磷酸化IR底物(S)1/2(Tyr612) 兔多克隆抗体购自Santa Cruz公司。
1.2 细胞培养 将L02细胞接种于含10%灭活胎牛血清的新鲜RPMI-1640培养液中,置37℃、饱和湿度5%CO2培养箱中孵育。当细胞80%长满或接近汇合成片时则进行传代。吸出培养瓶内旧培养液,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞一次,然后加入胰蛋白酶溶液少许进行消化,以能覆满瓶底为限。在室温中,于倒置显微镜下观察,当发现细胞胞质回缩,细胞间隙增大后,立即终止消化。吸除消化液,加入培养液,用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞,使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。将细胞悬液分为三等份装入三个培养瓶中,置于37℃恒温培养箱中培养。
1.3 细胞分组与处理 所有实验均采用处在对数生长期的L02细胞进行实验。将已传代培养的细胞培养2 d左右时间,吸出培养瓶内旧培养液,用PBS洗涤细胞3次。对照组(BSA组)换含相应浓度的BSA的无血清的RPMI-1640培养液培养,PA组换含实验浓度的PA的无血清RPMI-1640培养液培养,PA+MT组换含10 μmol/L MT和0.3 mmol/L PA的无血清RPMI-1640培养液培养,PA+维生素VitC)组换含1 mmol/L VitC和0.3 mmol/L PA的无血清RPMI-1640培养液培养,培养时间根据实验需要。
1.4 细胞中活性氧自由基(ROS)的测定 根据实验处理L02细胞后,加入终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA荧光探针,37℃孵育20 min以后收集细胞至离心管,1 000 r/min离心5 min,弃上清,加入PBS吹散细胞,重复洗2遍,弃去未反应的DCFH-DA。每管沉淀内加入300 μl PBS吹散细胞,避光。用荧光分光光度计检测细胞内的平均荧光强度,激发波长488 nm,发射波长530 nm,细胞进行蛋白定量。根据细胞内DCF的荧光强度,可反映出细胞内ROS的浓度。
1.5 Western 印迹检测信号蛋白磷酸化水平 L02细胞分3组(BSA对照组,0.3 mmol/L PA处理组,0.3 mmol PA+10 μmol/L MT处理组)培养24 h。各组细胞弃培养液,用预冷PBS洗涤3次。各组细胞换以含10-6mol/L胰岛素的新鲜无血清RPMI-1640培养液,温育15 min。收集细胞,用细胞裂解液冰上作用20 min。超声破碎,4℃、12 000 r/min离心25 min。取上清液用BCA法测定蛋白质浓度。将蛋白质与等体积的5倍上样电泳缓冲液混合,煮沸5 min。调整蛋白质含量为60 μg/孔上样进行10%SDS-PAGE凝胶电泳,于4℃下300 mA电转印1 h至硝酸纤维素膜,加入3%BSA封闭液,4℃封闭过夜。弃去封闭液,加入用3% BSA,按1∶500稀释的一抗,4℃封闭过夜。弃去杂交液,用含0.05%Tween-20的TBS-T洗液洗膜3次,加入3% BSA稀释二抗(碱性磷酸酶标记驴抗兔,稀释度1∶1 000),37℃孵育90 min。弃去杂交液,用含0.05%Tween-20的TBS-T洗液洗膜3次,将膜浸入NBT/BCIP显色液中,室温下放置20 min左右,待条带显色清楚后用水冲洗,将条带拍照扫描定量并进行图像分析。
1.6 统计学方法 采用SPSS11.5统计学软件进行方差分析及SNK-q检验。
2.1 PA影响L02细胞胞内ROS含量的剂量变化关系 用不同浓度(0、0.1、0.3、0.5 mmol/L)的饱和脂肪酸PA处理L02细胞24 h,测定细胞内的ROS含量,分别为(20.5±2.33)、(29.3±3.37)、(42.8±4.15)、(46.1±4.37)相对荧光度/mg蛋白。ROS含量呈现明显的浓度依赖关系(P<0.05)。
2.2 PA影响L02细胞胞内ROS含量的时间变化关系 用0.3 mmol/L的PA处理L02细胞不同时间(0、2、6、12、24、36 h),结果显示ROS含量存在明显的时间依赖关系〔分别为(20.7±2.34)、(18.8±2.25)、(23.3±2.79)、(29.6±3.14)、(41.5±4.63)、(34.6±4.17)相对荧光度/mg蛋白〕,在24 h达到最高,并在36 h后仍维持较高水平(P<0.05)。
2.3 MT和Vit C对L02细胞胞内ROS含量的影响 与BSA组(21.34±2.41 相对荧光度/mg 蛋白)相比,PA组(46.62±4.54相对荧光度/mg 蛋白)的ROS含量明显升高(P<0.05);PA+MT组(21.34±2.41相对荧光度/mg 蛋白)ROS含量明显低于PA组(P<0.05);PA+MT组与BSA组相比,ROS含量没有显著差异(P>0.05);PA+VitC组(34.16±3.82相对荧光度/mg 蛋白)与PA组相比,ROS的含量减少,但仍高于PA+MT组(P<0.05),表明MT比VitC有更强的清除ROS能力。
2.4 PA和MT处理对L02细胞内胰岛素通路中信号蛋白磷酸化水平的影响 PA组与BSA组相比,Y-p-IR(灰度值0.63±0.12 vs 1.00±0.20,P<0.05)和Y-p-IRS1/2磷酸化水平减少(灰度值0.71±0.15 vs 1.00±0.19,P<0.05);PA+MT组与PA组相比,Y-p-IR和Y-p-IRS1/2磷酸化水平升高(灰度值0.85±0.16,灰度值0.94±0.16 vs 0.71±0.15,均P<0.05)。见图1。
2.5 PA和MT处理对L02细胞内蛋白激酶JNK磷酸化水平的影响 PA组与BSA组相比,p-JNK磷酸化水平升高(灰度值1.46±0.28 vs 1.00±0.18,P<0.05);PA+MT组与PA组相比,p-JNK磷酸化水平减少(灰度值1.16±0.21,P<0.05)。见图1。
图1 Western印迹检测L02细胞信号蛋白和激酶的磷酸化水平
研究表明,血浆中FFA浓度增高是引起胰岛素抵抗和T2DM的重要危险因素之一〔4,5〕。高FFA能够通过线粒体解耦联、β氧化、氨基己糖途径的激活引起线粒体活性氧ROS的形成〔6〕。研究证实,ROS是机体多种因素诱导胰岛素抵抗的共同途径,在胰岛素抵抗发生发展中发挥重要作用〔7〕。本研究发现,用不同浓度的饱和脂肪酸PA孵育L02细胞24 h,细胞内的ROS含量明显升高,呈浓度依赖性,这种现象与Frankie等〔8〕在血管内皮细胞中和Duvala等〔9〕在肌细胞中观察的结果一致。ROS的生成量还与FFA孵育时间有关,随着孵育时间的延长,细胞内ROS水平逐渐增高,在24 h达到高峰,并且在36 h仍维持在高水平。本实验结果表明,高浓度的FFA能够在L02细胞中诱导ROS的生成,过量的ROS可破坏细胞的抗氧化防御体系,使细胞产生氧化应激,从而造成细胞损伤,这也是过量FFA脂毒性的重要内容。MT具有复杂而广泛的生理药理作用,它能维持昼夜节律、促进睡眠,能增强人体免疫功能,对生长发育、性功能、内分泌和胞内信号也具有调节功能〔10〕。很早的研究发现〔11〕,MT具有强大的抗氧化作用,是目前已知的体内抗氧化作用最强的自由基清除剂。本研究显示,补充抗氧化剂能明显减少高MT导致的细胞内ROS升高,其中MT清除ROS能力远远大于抗氧化剂VitC,使细胞中PA产生的高浓度ROS恢复到正常水平,本研究结果在L02细胞中进一步证实了MT强大的抗氧化清除自由基ROS能力。
在肝细胞,胰岛素与IR的α亚基结合后,引起受体β亚基的酪氨酸残基自身磷酸化,通过激活IR胞质段酪氨酸激酶识别募集IRS家族的各个成员,将IRS蛋白多个位点酪氨酸残基磷酸化,后者再与含有SH2结构域的多种蛋白结合,通过RAS/MAPK、PI3K/PKB和PKC等途径传导从而调节肝细胞蛋白质合成、脂质代谢、糖代谢、细胞生长和分化等。在胰岛素信号转导的诸多环节中任何部分的异常,均会造成胰岛素受体信号转导缺陷,可能导致胰岛素抵抗的发生〔12〕。研究表明,肥胖伴胰岛素抵抗和T2DM患者的多种组织细胞IR的酪氨酸激酶活性是降低的。在内皮细胞中,高浓度FFA可以通过抑制PKB等信号通路影响胰岛素的信号传导〔13〕,而在高脂喂养及ob/ob肥胖大鼠中发现,肌肉的胰岛素抵抗与IRS的缺陷密切相关〔14〕。
应激敏感激酶c-Jun氨基末端激酶(JNK)在细胞分化、细胞凋亡、应激反应及多种疾病的发生与发展中起着至关重要的作用。JNK对细胞内的ROS非常敏感,ROS升高引起的氧化应激能够激活JNK,活化应激敏感信号通路,作用于不同的组织器官,能最终导致胰岛素抵抗、β细胞功能紊乱、糖尿病并发症的出现〔15〕。JNK属于丝/苏氨酸磷酸化激酶,可使IRS丝氨酸磷酸化,阻碍正常的酪氨酸磷酸化,导致正常的酪氨酸磷酸化受抑制,影响胰岛素受体与IRS的结合,最终减弱IRS介导的胰岛素信号传递,导致胰岛素抵抗。Nguyen等〔16〕和Solinas等〔17〕分别在脂肪细胞和肝细胞中证实,JNK能被FFA激活,活化的JNK是FFA诱导细胞胰岛素抵抗的主要中介体,而使用JNK的肽抑制剂或敲除JNK基因阻止IRS1的Ser307的磷酸化,增强胰岛素信号传递,改善了胰岛素抵抗状态〔18,19〕。
本研究提示胰岛素信号传导在上游已经受损,因IR信号转导缺陷是胰岛素抵抗发生的主要原因,这也表明L02细胞已经出现了胰岛素抵抗。ROS引起的氧化应激减少后,JNK的活化作用减弱,同时,胰岛素信号传递功能却得到增强,胰岛素信号上游的多处受损的信号分子如IR、IRS酪氨酸磷酸化水平升高,活性部分增强,这标志胰岛素信号转导功能得到改善,因此,MT对PA诱导的干细胞胰岛素抵抗具有有效的防护作用。
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〔2016-01-24修回〕
(编辑 苑云杰/曹梦园)
河南科技大学创新能力培育基金(No.2012ZCX024)
席守民(1968-),男,硕士,教授,硕士生导师,主要从事疾病及药物的分子基础研究。
万学东(1966-),男,博士,副教授,主要从事信号转导与疾病的研究。
R961
A
1005-9202(2017)13-3183-03;
10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.026
1 天津市东丽区中医医院外科