褪黑素对软脂酸诱导L02细胞胰岛素抵抗的防护作用及机制

万学东 王 博 陈群力 李三强 席守民

(河南科技大学医学院生物化学与分子生物学教研室，河南 洛阳 471003)

褪黑素对软脂酸诱导L02细胞胰岛素抵抗的防护作用及机制

万学东 王 博1陈群力 李三强 席守民

(河南科技大学医学院生物化学与分子生物学教研室，河南 洛阳 471003)

目的 探讨褪黑素(MT)对软脂酸(PA)诱导L02细胞胰岛素抵抗的防护作用及机制。方法 培养L02细胞，分别设立对照组(BSA组)、PA组、PA+MT组、PA+维生素C(VitC)组。各组药物浓度和孵育时间根据不同的实验需要来确定。用荧光比色法测定各组细胞胞内氧自由基(ROS)水平，Western印迹法检测胰岛素刺激后胞内胰岛素信号蛋白磷酸化水平，包括Y-p-胰岛素受体(IR)、Y-p-胰岛素受体底物(IRS)1/2以及应激敏感激酶p-JNK水平。结果 用不同浓度的PA处理L02细胞24 h，细胞内ROS生成量呈现明显的浓度依赖关系，差异有统计学意义(P<0.05)；用0.3 mmol/L的PA处理L02细胞不同时间，细胞内ROS生成量存在明显的时间依赖关系，在24 h达到最高，并在36 h后仍维持较高水平(P<0.05)；与BSA组相比，PA组ROS含量明显升高(P<0.05)PA+MT组ROS含量无明显变化(P>0.05)；PA+MT组ROS生成量明显低于PA组(P<0.05)。PA+VitC组与PA组相比，ROS的生成量减少，但仍高于PA+MT组(P<0.05)。与BSA组相比，PA组Y-p-IR、Y-p-IRS1/2磷酸化水平减少，而p-JNK磷酸化水平升高；与PA组相比，PA+MT组Y-p-IR、Y-p-IRS1/2磷酸化水平显著升高，p-JNK磷酸化水平明显降低(P<0.05)。结论 PA导致细胞内ROS增加，MT能够清除PA产生的过量ROS。MT通过减少JNK的活化，改善因ROS引起的胰岛素信号传递损伤，对PA诱导的胰岛素抵抗具有防护作用。

胰岛素抵抗；活性氧ROS；褪黑素；胰岛素受体；胰岛素受体底物1/2；c-Jun 氨基末端激酶JNK

胰岛素抵抗是2型糖尿病(T2DM)的基本病理生理现象之一，并贯穿其发生发展的始终。血清游离脂肪酸(FFA)水平升高，在胰岛素抵抗早期已经发挥作用，是导致胰岛素抵抗的重要的危险因素之一，也是糖尿病脂毒学说的重要内容〔1〕。氧化应激作为一种重要的病理生理过程，参与了胰岛素抵抗的形成，同时也是糖尿病各种慢性并发症的共同基础〔2〕。褪黑素(MT)是由松果体分泌的一种神经激素，可以通过各种膜结构进入细胞发挥强大的抗氧化、抗自由基功能〔3〕。本研究观察并分析MT对人胚胎干细胞L02细胞形成胰岛素抵抗的防护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 PA、MT、2＇，7＇-二氯氢化荧光素二酯(DCFH-DA)、无血清白蛋白(BSA)等购自Sigma公司(USA)；胎牛血清(浙江三利公司)；RPMI-1640培养基(Gibco，USA)；磷酸化JNK(Thr183/Tyr185)和β-actin鼠多克隆抗体、磷酸化胰岛素受体(IR)(Tyr1162/1163)兔多克隆抗体、磷酸化IR底物(S)1/2(Tyr612) 兔多克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养 将L02细胞接种于含10%灭活胎牛血清的新鲜RPMI-1640培养液中，置37℃、饱和湿度5%CO2培养箱中孵育。当细胞80%长满或接近汇合成片时则进行传代。吸出培养瓶内旧培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞一次，然后加入胰蛋白酶溶液少许进行消化，以能覆满瓶底为限。在室温中，于倒置显微镜下观察，当发现细胞胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。吸除消化液，加入培养液，用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。将细胞悬液分为三等份装入三个培养瓶中，置于37℃恒温培养箱中培养。

1.3 细胞分组与处理 所有实验均采用处在对数生长期的L02细胞进行实验。将已传代培养的细胞培养2 d左右时间，吸出培养瓶内旧培养液，用PBS洗涤细胞3次。对照组(BSA组)换含相应浓度的BSA的无血清的RPMI-1640培养液培养，PA组换含实验浓度的PA的无血清RPMI-1640培养液培养，PA+MT组换含10 μmol/L MT和0.3 mmol/L PA的无血清RPMI-1640培养液培养，PA+维生素VitC)组换含1 mmol/L VitC和0.3 mmol/L PA的无血清RPMI-1640培养液培养，培养时间根据实验需要。

1.4 细胞中活性氧自由基(ROS)的测定 根据实验处理L02细胞后，加入终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA荧光探针，37℃孵育20 min以后收集细胞至离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入PBS吹散细胞，重复洗2遍，弃去未反应的DCFH-DA。每管沉淀内加入300 μl PBS吹散细胞，避光。用荧光分光光度计检测细胞内的平均荧光强度，激发波长488 nm，发射波长530 nm，细胞进行蛋白定量。根据细胞内DCF的荧光强度，可反映出细胞内ROS的浓度。

1.5 Western 印迹检测信号蛋白磷酸化水平 L02细胞分3组(BSA对照组，0.3 mmol/L PA处理组，0.3 mmol PA+10 μmol/L MT处理组)培养24 h。各组细胞弃培养液，用预冷PBS洗涤3次。各组细胞换以含10-6mol/L胰岛素的新鲜无血清RPMI-1640培养液，温育15 min。收集细胞，用细胞裂解液冰上作用20 min。超声破碎，4℃、12 000 r/min离心25 min。取上清液用BCA法测定蛋白质浓度。将蛋白质与等体积的5倍上样电泳缓冲液混合，煮沸5 min。调整蛋白质含量为60 μg/孔上样进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，于4℃下300 mA电转印1 h至硝酸纤维素膜，加入3%BSA封闭液，4℃封闭过夜。弃去封闭液，加入用3% BSA，按1∶500稀释的一抗，4℃封闭过夜。弃去杂交液，用含0.05%Tween-20的TBS-T洗液洗膜3次，加入3% BSA稀释二抗(碱性磷酸酶标记驴抗兔，稀释度1∶1 000)，37℃孵育90 min。弃去杂交液，用含0.05%Tween-20的TBS-T洗液洗膜3次，将膜浸入NBT/BCIP显色液中，室温下放置20 min左右，待条带显色清楚后用水冲洗，将条带拍照扫描定量并进行图像分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS11.5统计学软件进行方差分析及SNK-q检验。

2 结 果

2.1 PA影响L02细胞胞内ROS含量的剂量变化关系 用不同浓度(0、0.1、0.3、0.5 mmol/L)的饱和脂肪酸PA处理L02细胞24 h，测定细胞内的ROS含量，分别为(20.5±2.33)、(29.3±3.37)、(42.8±4.15)、(46.1±4.37)相对荧光度/mg蛋白。ROS含量呈现明显的浓度依赖关系(P<0.05)。

2.2 PA影响L02细胞胞内ROS含量的时间变化关系 用0.3 mmol/L的PA处理L02细胞不同时间(0、2、6、12、24、36 h)，结果显示ROS含量存在明显的时间依赖关系〔分别为(20.7±2.34)、(18.8±2.25)、(23.3±2.79)、(29.6±3.14)、(41.5±4.63)、(34.6±4.17)相对荧光度/mg蛋白〕，在24 h达到最高，并在36 h后仍维持较高水平(P<0.05)。

2.3 MT和Vit C对L02细胞胞内ROS含量的影响 与BSA组(21.34±2.41 相对荧光度/mg 蛋白)相比，PA组(46.62±4.54相对荧光度/mg 蛋白)的ROS含量明显升高(P<0.05)；PA+MT组(21.34±2.41相对荧光度/mg 蛋白)ROS含量明显低于PA组(P<0.05)；PA+MT组与BSA组相比，ROS含量没有显著差异(P>0.05)；PA+VitC组(34.16±3.82相对荧光度/mg 蛋白)与PA组相比，ROS的含量减少，但仍高于PA+MT组(P<0.05)，表明MT比VitC有更强的清除ROS能力。

2.4 PA和MT处理对L02细胞内胰岛素通路中信号蛋白磷酸化水平的影响 PA组与BSA组相比，Y-p-IR(灰度值0.63±0.12 vs 1.00±0.20，P<0.05)和Y-p-IRS1/2磷酸化水平减少(灰度值0.71±0.15 vs 1.00±0.19，P<0.05)；PA+MT组与PA组相比，Y-p-IR和Y-p-IRS1/2磷酸化水平升高(灰度值0.85±0.16，灰度值0.94±0.16 vs 0.71±0.15，均P<0.05)。见图1。

2.5 PA和MT处理对L02细胞内蛋白激酶JNK磷酸化水平的影响 PA组与BSA组相比，p-JNK磷酸化水平升高(灰度值1.46±0.28 vs 1.00±0.18，P<0.05)；PA+MT组与PA组相比，p-JNK磷酸化水平减少(灰度值1.16±0.21，P<0.05)。见图1。

图1 Western印迹检测L02细胞信号蛋白和激酶的磷酸化水平

3 讨 论

研究表明，血浆中FFA浓度增高是引起胰岛素抵抗和T2DM的重要危险因素之一〔4，5〕。高FFA能够通过线粒体解耦联、β氧化、氨基己糖途径的激活引起线粒体活性氧ROS的形成〔6〕。研究证实，ROS是机体多种因素诱导胰岛素抵抗的共同途径，在胰岛素抵抗发生发展中发挥重要作用〔7〕。本研究发现，用不同浓度的饱和脂肪酸PA孵育L02细胞24 h，细胞内的ROS含量明显升高，呈浓度依赖性，这种现象与Frankie等〔8〕在血管内皮细胞中和Duvala等〔9〕在肌细胞中观察的结果一致。ROS的生成量还与FFA孵育时间有关，随着孵育时间的延长，细胞内ROS水平逐渐增高，在24 h达到高峰，并且在36 h仍维持在高水平。本实验结果表明，高浓度的FFA能够在L02细胞中诱导ROS的生成，过量的ROS可破坏细胞的抗氧化防御体系，使细胞产生氧化应激，从而造成细胞损伤，这也是过量FFA脂毒性的重要内容。MT具有复杂而广泛的生理药理作用，它能维持昼夜节律、促进睡眠，能增强人体免疫功能，对生长发育、性功能、内分泌和胞内信号也具有调节功能〔10〕。很早的研究发现〔11〕，MT具有强大的抗氧化作用，是目前已知的体内抗氧化作用最强的自由基清除剂。本研究显示，补充抗氧化剂能明显减少高MT导致的细胞内ROS升高，其中MT清除ROS能力远远大于抗氧化剂VitC，使细胞中PA产生的高浓度ROS恢复到正常水平，本研究结果在L02细胞中进一步证实了MT强大的抗氧化清除自由基ROS能力。

在肝细胞，胰岛素与IR的α亚基结合后，引起受体β亚基的酪氨酸残基自身磷酸化，通过激活IR胞质段酪氨酸激酶识别募集IRS家族的各个成员，将IRS蛋白多个位点酪氨酸残基磷酸化，后者再与含有SH2结构域的多种蛋白结合，通过RAS/MAPK、PI3K/PKB和PKC等途径传导从而调节肝细胞蛋白质合成、脂质代谢、糖代谢、细胞生长和分化等。在胰岛素信号转导的诸多环节中任何部分的异常，均会造成胰岛素受体信号转导缺陷，可能导致胰岛素抵抗的发生〔12〕。研究表明，肥胖伴胰岛素抵抗和T2DM患者的多种组织细胞IR的酪氨酸激酶活性是降低的。在内皮细胞中，高浓度FFA可以通过抑制PKB等信号通路影响胰岛素的信号传导〔13〕，而在高脂喂养及ob/ob肥胖大鼠中发现，肌肉的胰岛素抵抗与IRS的缺陷密切相关〔14〕。

应激敏感激酶c-Jun氨基末端激酶(JNK)在细胞分化、细胞凋亡、应激反应及多种疾病的发生与发展中起着至关重要的作用。JNK对细胞内的ROS非常敏感，ROS升高引起的氧化应激能够激活JNK，活化应激敏感信号通路，作用于不同的组织器官，能最终导致胰岛素抵抗、β细胞功能紊乱、糖尿病并发症的出现〔15〕。JNK属于丝/苏氨酸磷酸化激酶，可使IRS丝氨酸磷酸化，阻碍正常的酪氨酸磷酸化，导致正常的酪氨酸磷酸化受抑制，影响胰岛素受体与IRS的结合，最终减弱IRS介导的胰岛素信号传递，导致胰岛素抵抗。Nguyen等〔16〕和Solinas等〔17〕分别在脂肪细胞和肝细胞中证实，JNK能被FFA激活，活化的JNK是FFA诱导细胞胰岛素抵抗的主要中介体，而使用JNK的肽抑制剂或敲除JNK基因阻止IRS1的Ser307的磷酸化，增强胰岛素信号传递，改善了胰岛素抵抗状态〔18，19〕。

本研究提示胰岛素信号传导在上游已经受损，因IR信号转导缺陷是胰岛素抵抗发生的主要原因，这也表明L02细胞已经出现了胰岛素抵抗。ROS引起的氧化应激减少后，JNK的活化作用减弱，同时，胰岛素信号传递功能却得到增强，胰岛素信号上游的多处受损的信号分子如IR、IRS酪氨酸磷酸化水平升高，活性部分增强，这标志胰岛素信号转导功能得到改善，因此，MT对PA诱导的干细胞胰岛素抵抗具有有效的防护作用。

1 许旭昀，池莲祥.脂毒学说与糖尿病〔J〕.中国实用医药，2008；3(20)：181-3.

2 任春久，张 瑶，崔为正，等.氧化应激在2型糖尿病发病机制中的作用研究进展〔J〕.生理学报，2013；65(6)：664-73.

3 Hardeland R.Antioxidative protection by melatonin：multiplicity of mechanisms from radical detoxifcation to radical avoidance〔J〕.Endocrine，2005；27(2)：119-30.

4 Fukuchi S，Hamaguchi K，Seike M，etal.Role of fatty acid composition in the development of metabolic disorders in sucrose-induced obese rats〔J〕.Exp Biol Med (Maywood)，2004；229(6)：486-93.

5 Thomas T，Pfeiffer AF.Foods for the prevention of diabetes：how do they work〔J〕?Diabetes Metab Res Rev，2012；28(1)：25-49.

6 Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications〔J〕.Nature，2001；414(6865)：813-20.

7 Houstis N，Rosen ED，Lander ES.Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance〔J〕.Nature，2006；440(7086)：944-8.

8 Frankie B，Stentz FB，Abbas E，etal.Palmitic acid-induced activation of human T-lymphocytes and aortic endothelial cells with production of insulin receptors，reactive oxygen species，cytokines，and lipid peroxidation〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2006；346(3)：721-6.

9 Duvala C，Camaraa Y，Hondares E，etal.Overexpression of mitochondrial uncoupling protein-3 does not decrease production of the reactive oxygen species，elevated by palmitate in skeletal muscle cells〔J〕.FEBS Lett，2007；58(5)：955-61.

10 Reiter R，Tang L，Garcia JJ，etal.Pharmacological actions of melatonin in oxygen radical pathophysiology〔J〕.Life Sci，1997；60(25)：2255-71.

11 Reiter R，Melchiorri D，Sewerynek E，etal.A review of the evidence supporting melatonin′s role as an antioxidant〔J〕.J Pineal Res，1995；18(1)：1-11.

12 窦 梅，马爱国.胰岛素抵抗主要原因及机制的研究进展〔J〕.国外医学(卫生学分册)，2009；36(3)：174-9.

13 Kubota T，Kubota N，Kumagai H.Impaired insulin signaling in endothelial cells reduces insulin-induced glucose uptake by skeletal muscle〔J〕.Cell Metab，2011；13(3)：294-307.

14 Park K，Li Q，Rask-Madsen C，etal.Serine phosphorylation sites on IRS2 activated by angiotensin Ⅱ and protein kinase C to induce selective insulin resistance in endothelial cells〔J〕.Mol Cell Biol，2013；33(16)：3227-41.

15 Hirosumi J，Tuncman G，Chang L，etal.A central role for JNK in obesity and insulin resistance〔J〕.Nature，2002；420(6913)：333-6.

16 Nguyen MT，Satoh H，Favelyukis S，etal.JNK and tumor necrosis factor-alpha mediate free fatty acid-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes〔J〕.J Biol Chem，2005；280(42)：35361-71.

17 Solinas G，Naugler W，Galimi F，etal.Saturated fatty acids inhibit induction of insulin gene transcription by JNK-mediated phosphorylation of insulin-receptor substrates〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2006；103(44)：16454-9.

18 Kaneto H，Nakatani Y，Miyatsuka T，etal.Possible novel therapy for diabetes with cell-permeable JNK-inhibitory peptide〔J〕.Nat Med，2004；10(10)：1128-32.

19 Nakatani Y，Kaneto H，Kawamori D，etal.Modulation of the JNK pathway in liver affects insulin resistance status〔J〕.J Biol Chem，2004；279(44)：45803-9.

〔2016-01-24修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河南科技大学创新能力培育基金(No.2012ZCX024)

席守民(1968-)，男，硕士，教授，硕士生导师，主要从事疾病及药物的分子基础研究。

万学东(1966-)，男，博士，副教授，主要从事信号转导与疾病的研究。

R961

A

1005-9202(2017)13-3183-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.026

1 天津市东丽区中医医院外科