百草枯诱导的SH-SY5Y细胞中核连蛋白2基因的表达变化

田小菲 张 晓 张经一 王 芳 张亚星 张国徽 庞 灏

(河北北方学院法医教研室，河北 张家口 075000)

百草枯诱导的SH-SY5Y细胞中核连蛋白2基因的表达变化

田小菲 张 晓1张经一1王 芳1张亚星1张国徽 庞 灏2

(河北北方学院法医教研室，河北 张家口 075000)

目的 检测核连蛋白(NUCB)2在百草枯(PQ)诱导的SH-SY5Y细胞中的表达变化，分析NUCB2在PQ引起的SH-SY5Y细胞凋亡中的作用机制。方法 采用MTT法进行SH-SY5Y细胞毒性分析。选择PQ作用的最佳浓度和时间点，进一步收取经PQ处理后的SH-SY5Y总RNA，首先采用RT-PCR方法观察NUCB2的表达趋势，然后采用real-time PCR方法进行NUCB2基因进行表达变化检测，采用ΔΔCt法进行定量比较分析。结果 MTT方法在酶标仪490 nm波长下，分析得到PQ的最佳作用浓度和时间是0.5 mmol/L作用24 h，此时细胞活力较对照组低约41.67%；采用ΔΔCt法进行定量比较分析，发现NUCB2在mRNA水平的表达量明显降低(P=0.001 6)；Western印迹检测发现SH-SY5Y细胞经PQ诱导后引起了caspase-3酶原形式的表达量降低(P<0.05)。结论 NUCB2基因在经PQ诱导后的SH-SY5Y细胞中表达量明显降低，分析其可能在神经细胞的凋亡机制中发挥重要作用。

核连蛋白(NUCB)2；PQ；SH-SY5Y；凋亡

SH-SY5Y细胞系是帕金森病(PD)发病机制研究中一种常见的体外模型，因其有多巴胺能神经元的一些特性〔1〕，此细胞可分泌酪氨酸羟化酶、β-多巴胺羟化酶和多巴胺转运蛋白。百草枯(PQ)可为活性氧种属产生的激活因素之一〔2，3〕，位于细胞膜上的这些小叶状活性氧簇(ROS)不饱和脂类的相互作用，将对细胞器造成一定损坏，进而导致细胞死亡的发生〔4〕。细胞凋亡涉及众多凋亡相关基因和多种信号通道，核连蛋白(NUCB)2也称为非酯化脂肪酸(NEFA)蛋白，此蛋白与1型肿瘤坏死因子(TNF)受体(TNFR)脱落氨肽酶调控因子(ARTS-1)形成的复合物能对TNFR1的释放进行调节，从而影响TNFα-TNFR1系统介导的细胞凋亡的过程〔5〕，同时凋亡发生过程中的半胱氨酸蛋白酶(caspase)能对NUCB2进行裂解〔6〕。目前国内外还没有NUCB2所参与的神经细胞死亡机制的相关报道，本研究拟采用PQ诱导SH-SY5Y细胞建立PD的发病机制模型，以探讨NUCB2在经PQ诱导后的神经细胞中的表达变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料 神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购于中科院细胞中心(源自美国ATCC)；胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培养基，Hyclone公司；噻唑蓝(MTT)，凯基公司；PQ，Sigma公司；Ex-Taq试剂盒，RT-PCR试剂盒和SYBR试剂盒，TaKaRa公司；TRIZOL试剂，Millpore公司。

1.2 细胞培养 人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y用含有10% FBS的DMEM/F12培养液(青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml)悬浮，以大约5×106个/ml的密度接种于直径10 cm的培养皿，置于细胞培养箱中，在37℃，5%CO2，湿化条件下培养，待细胞覆盖率达90%左右时，常规胰酶消化传代。

1.3 MTT进行细胞毒性分析 选用不同浓度的PQ(0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5 mmol/L)作用浓度作用于SH-SY5Y细胞不同时间(6，18，24，48 h)后，采用MTT方法进行细胞毒性分析，选择最佳的PQ作用浓度和时间。

1.4 NUCB2 mRNA水平的表达变化检测 根据1.3中的结果选择PQ作用的最佳浓度和时间点，收取SH-SY5Y细胞总RNA，反转录成cDNA。设计NUCB2的特异性引物，β-actin上游引物5′-AGATGACCCAGATCATGTTTG-3′,下游引物5′-ATCACGATGCCAGTGGTA-3′;NUCB2上游引物5′-AGGCAGATGAGCTTCAGA-3′,下游引物5′-TCTGCTGTATGACCTGATGA-3′。采用RT-PCR和real-time方法对处理前后的SH-SY5Y细胞中NUCB2在mRNA水平的表达进行检测。采用ΔΔCt法对实验组与对照组之间NUCB2基因表达量变化进行定量分析，三组样品分别进行分析3次。

1.5 caspase-3的检测 根据1.3中的结果选择PQ作用的最佳浓度和时间点，收取SH-SY5Y细胞总蛋白，采用Western印迹方法进行caspase-3激活情况的检测。用凝胶自动分析成像软件FluorChem V2.0进行蛋白灰度值(分别以caspase-3的整合密度值比内参β-actin的整合密度值)分析，进而做定量比较，三组样品分别进行分析3次。

1.6 统计学方法 采用Excel2007进行t检验。

2 结 果

2.1 PQ作用最佳浓度及时间选择 MTT方法在酶标仪490 nm波长下，分析得到的细胞经不同浓度处理6、18、24、48 h的生存活力，因6、18 h细胞活性无明显差异，48 h细胞死亡太多，故仅对24 h进行分析，见图1，0.5 mmol/L PQ作用24 h后，细胞活力相对于未经PQ作用组比较降低了约41.67%，标准偏差为0.033；虽然随着PQ浓度的增大，细胞生存活力降低越明显，但是当PQ浓度大于0.5 mmol/L以后，显微镜下观察SH-SY5Y细胞即出现皱缩，呈现出明显的病理形态，所以不宜选择大于0.5 mmol/L的PQ浓度进行后续分析。

2.2 caspase-3表达检测 SH-SY5Y细胞经PQ诱导后活性明显降低，进一步收取SH-SY5Y细胞经0.5 mmol/L PQ作用24 h后的总蛋白，进行caspase-3酶原形式的表达量变化检测。SH-SY5Y经PQ作用后，导致了caspase-3酶原形式的表达量降低(P<0.05)。见图2。

2.3 NUCB2 mRNA表达检测 SH-SY5Y细胞经0.5 mmol/L PQ作用24 h后，PQ组NUCB2 mRNA水平的表达量(1.452 715±0.038 37)明显低于对照组(1.519 701±0.057 78)(P<0.05)。见图3。

图1 PQ作用于SH-SY5Y 24 h后MTT分析图

图2 caspase-3表达检测

图3 NUCB2 mRNA表达水平

3 讨 论

有报道SH-SY5Y细胞经凋亡诱导剂作用后，将导致此细胞各种凋亡现象的发生〔7〕，因其有多巴胺能神经元的一些特性，因此SH-SY5Y细胞模型已在由PQ引起的PD发病机制的研究中得到了广泛认可。流行病学报道显示，经常接触PQ的人群患PD的概率明显增高〔8，9〕。有报道在经PQ作用后的神经细胞，亦有线粒体膜电位发生改变，进而引起细胞色素C的释放，caspase凋亡途径的激活等的相关报道〔10〕。内环境中Ca2+的紊乱，也是细胞凋亡的一个主要诱因。正常情况下，胞外液中Ca2+的浓度为1 mmol/L水平，而胞质内游离Ca2+的浓度为0.1 mmol/L。当经1-甲基-4-苯基-吡啶(MPP+)作用后，可引起机体Ca2+内环境稳态的紊乱，进而诱发细胞色素C的释放，激活caspase-3调控的凋亡途径的发生，进而引起细胞死亡的发生〔11〕，而PQ的化学结构与其极其相似〔12〕，本研究显示caspase-3酶原形式的表达量经PQ作用之后明显降低。

NUCB2可参与TNFα-TNFR1系统介导的细胞凋亡的过程〔5〕，参与调节细胞内外 Ca2+的内环境稳定。NUCB2可调节神经元胞质内Ca2+的稳态〔13〕。胞外TNFR1与NUCB2-Arts1结合形成复合物，进而影响其与TNF-α的结合，从而影响TNFα-TNFR1系统介导的程序性细胞死亡过程的发生〔14〕。当TNFα与TNFR1结合后，激活细胞凋亡信号，启动细胞内半胱氨酸天冬氨酸酶的级联反应过程，诱导细胞凋亡的发生〔15〕，又有报道，细胞凋亡发生过程中的caspase能对NUCB2进行裂解〔6〕。本研究发现，当PQ作用于SH-SY5Y细胞后，神经细胞的存活率明显降低，同时发现，细胞凋亡过程中涉及的重要蛋白酶caspase-3酶原形式的表达量经PQ作用之后亦明显降低。PQ作用于SH-SY5Y细胞之后引起了细胞凋亡的发生，进一步发现经PQ处理组NUCB2的表达量明显低于对照组。

综上，可得NUCB2的表达变化参与了TNFα-TNFR1系统介导的细胞凋亡的过程，但是又因为细胞凋亡激活信号引起的caspase的激活可能导致了NUCB2的降解。即在整个过程中NUCB2既参与了TNFα-TNFR1系统介导的细胞凋亡途径的激活，又可能是caspase-3的作用底物。因此，NUCB2在PQ引起的神经细胞凋亡过程中的具体机制还需进一步研究探讨。

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〔2016-02-24修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河北省教育厅青年指导项目(Z2017027)

庞 灏(1962-)，男，教授，博士生导师，主要从事法医物证学研究。

田小菲(1983-)，女，讲师，主要从事法医学研究。

R285

A

1005-9202(2017)13-3158-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.016

1 河北北方学院2012级法医学本科1班

2 中国医科大学法医学院法医血清教研室