应用Taq Man荧光定量PCR技术建立HIV前病毒检测方法

温 瑞， 李黎明，孙 洁，孔维宾

(开封市疾病预防控制中心，河南 开封 475000)

应用Taq Man荧光定量PCR技术建立HIV前病毒检测方法

温 瑞， 李黎明，孙 洁，孔维宾

(开封市疾病预防控制中心，河南 开封 475000)

目的：使用荧光定量方法PCR对HIV前病毒进行检测，并建立相应预防机制。方法：对8E5细胞实施培育，然后收集并计数，将其核酸进行提取，并通过荧光定量来对HIV前病毒的逆转录基因片段实施扩增。 结果：通过实时PCR技术对HIV前病毒实施荧光定量检测，可达1拷贝的灵敏度，并取得较为稳定的扩增效果。 结论：利用PCR技术能够做到系统检测HIV前病毒，有利于日后对潜伏感染细胞的鉴定筛选以及对抗HIV治疗的及时反馈。

HIV前病毒；PCR技术；荧光定量

HIV作为最受关注的双链RNA逆转录病毒，主要感染具有CD4+表面标志的细胞，其中CD4+T细胞群是HIV攻击的主要靶细胞。CD4+T细胞活化后内部的HIV病毒的核酸嵌合细胞染色体，并逆转录RNA、剪切基因片段和翻译，在完成这一系列过程后会释放相当数量的病毒颗粒在细胞组织间，而本身的宿主细胞往往会因此死亡。但一部分的CD4+T细胞感染HIV病毒程度较轻，所产生的病毒颗粒数量极少甚至不产生，T细胞核内却嵌合(非嵌合形式也占相当数量)HIV前病毒的基因物质，从而导致潜伏性感染情况的发生[1]。HIV病毒以上述细胞为其屏障和滋生的病毒库，形成繁殖循环在适宜环境下再次复制相当数量的病毒，以实现自身在血浆中的快速增值。

当前技术条件下抑制HIV感染者血浆病毒滴度的临床手段主要为医学界通用的高活性抗逆转录病毒技术，即HAART，可以达到一定的疗效，然而在彻底清除患者淋巴组织和外周血的HIV前病毒上尚不能达到理想效果。HIV前病毒经过靶向HIV潜伏感染细胞治疗手段可以受到一定程度的抑制，所以通过荧光定量PCR技术检测HIV前病毒可以帮助优质抗HIV药物的鉴定筛选，对潜伏感染细胞的治疗有着良好的积极意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

8E5细胞中平均拷贝有1个HIV前病毒，本次试验由Invit．ogen公司提供培养基，使用GIB-O公司生产的链霉素、青霉素和胎牛血清，invitrogen公司提供荧光染料ROX，Promega公司的p GEM—T为载体产品，用生化试剂按通例使用；荧光定量PCR仪选用PE公司的ABl 7000，Aoker公司合成探针及引物。

1.2 检测方法

1.2.1 细胞培养 通过常规培养液RPMl 1640培养8E5细胞，其中加入1%青+链霉素和20%胎牛血清，在恒温恒湿的培养箱中放置细胞置。

1.2.2 提取HIV前病毒核酸 计算8E5细胞数量，离心操作，撇去上清液，随后加入悬浮细胞PBS，离心速度控制为800 r/min，重悬蛋白酶K，孵育样品在55℃下加入TNES饱和苯酚，充分晃动，收集上清并加入同量的氯仿/苯酚/异戊醇，再次室温下充分晃动，取上清，加大量乙醇，洗2次以上；保持干燥室温，溶解于ITE。

1.2.3 HIV前病毒扩增的Taq Man荧光定量标记 收集细胞(约106个)，提取HIV前病毒，依次10倍比例稀释，制成106～10。拷贝样品。荧光定量实时PCR检测为：5 u/t-lDNA聚合酶0．4 pl，扩增模板20 pl，25 pmol/L探针0．1 pl，5 t Llmol/L上下游引物，总体积30 pl。

1.2.4 鉴定HIV前病毒的扩增片段 将扩增结果再次经验，用2%琼脂糖凝胶对PCR反应产物进行电泳，拍照并在紫外灯下观察。p GEM—T载体在回收后应对其扩增片段进行克隆，最后测定PCR鉴定的序列。

1.3 统计学方法

本次使用的统计软件为 SPSS 19.0 ，建立数据库并采用软件包进行运算，以计量资料t来代表计算临床数据并检验分析，以来进行单因素分析的检验，以P< 0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Taq Man荧光定量PCR检测中的引物设计

在Taq Man荧光定量PCR检测中，对比序列的同源性，选择较为接近的基因片段，根据引物信息来设计序列，通过数据可以得出起始病毒数和PCR循环间存在相关性，显示出可靠的扩增结果。HIV前病毒基因TaqMan荧光定量PCR检测结果见表1。

表1 技术的构建

2.2 荧光定量PCR检测的应用检测结果

表2 TaqMan荧光定量PCR技术的样品检测

3 讨 论

目前，HIV病毒携带者血浆中的病毒数量可以通过高效抗逆转录病毒疗法来降低，从而在一定程度上控制艾滋病患者的临床症状恶化，但由于高效抗逆转录病毒疗法的疗程相对较长，服药期可长达数年至十数年以上，且不能停药，否则艾滋病患者体内的HIV病毒数量会出现反弹[2]。如果患者患病症状恶化，那么可能面临生命危险，而病毒数量出现反弹的原因可能在于HIV前病毒藏匿于患者体内细胞，HIV前病毒将人体细胞作为自身的温床和藏匿场所，得以避开药物的抑制作用，同时在适当条件下又会产生大量病毒排放到血浆中，形成恶性蔓延繁殖[3]。

感染较轻的CD4+T细胞所产生的病毒颗粒数量极少，只在T细胞核内却嵌合(或非嵌合形式)病毒的基因物质导致潜伏性感染，经细胞内多次复制循环后静息存在。HIV病毒以上述细胞为其屏障和滋生的病毒库，形成繁殖循环在适宜环境下再次复制相当数量的病毒，以实现自身在血浆中的快速增值[4]。

在实验中，静息CD4+T细胞表面和活化T细胞表面分别有着阴性和阳性的CD25标志，所以可用此作为T细胞活化区分的标准。T细胞群被感染后对CD25+T细胞进行抑制，可降低HIV核心蛋白的表达量，因此可以推断出CD25+T细胞是HIV前病毒的隐藏位置，采用Taq DNA聚合酶提高了准确性和检出率，也使其PCR的污染得到降低。HIV前病毒PCR检测在建立后与起始拷贝数和PCR循环数会有线性关系，可稳定扩增。具备特异性高的探针和引物，对病毒的LTR基因片段有针对性和重复性。

HIV的建立机制起于T淋巴细胞系，产生的LAV拷贝人体细胞中中的HIV基因，其HIV前病毒拷贝数可以借助于细胞计数得出，继而实现HIV检测建立。HIV FL片段在扩增后的长度大约在72 bp左右，其逆转录产物属于病毒复制晚期，其复制程度适于体内前病毒时期。HIV的基因复制可以被当下使用的HAART疗法在一定程度上得到控制，使得患者体内的HIV 血清水平得到降低。治疗HIV时患者的HⅣ血清水平可以通过Taq Man荧光定量PCR技术对HIV前病毒进行检测，对其RNA载量实现动态检测以增进艾滋病的治疗评价。建立完善的HIV前病毒系统检测机制能够剖析HIV感染原理，找到更为积极的防治措施，对于导向治疗和设计药物靶点有着实际的理论价值。

[1] 翟茂雄,唐 斌. HIV-1病毒储存库及检测方法的研究进展[J].医药导报，2013(4)：362-363.

[2] 张启顺，纪瑞霞 .HIV-1耐药性表型检测方法研究进展[J].中国微生态学杂志，2014，2(28)： 65-66.

[3] 江 虹，陈壁亮 .SYBR+Green+I荧光定量PCR检测HIV-1前病毒方法的建立及应用[J].中国医药导刊，2013，6(15)： 44-45.

[4] 向长茂. 柑桔溃疡病菌实时荧光定量PCR检测与应用[J].贵州医药，2011(1)：324-325.

本文编辑：王知平

温 瑞，女，主管技师，从事微生物检验工作

R446.1

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1671-0126(2017)03-0032-03