山西大医院金黄色葡萄球菌SCCmec型别分析

周永年，戎建荣，栗子洋，王瑞雪

(山西大医院，山西 太原 030032)

山西大医院金黄色葡萄球菌SCCmec型别分析

周永年，戎建荣*，栗子洋，王瑞雪

(山西大医院，山西 太原 030032)

目的：分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药特点。方法：采用Vitek-2 compact和Micro2flexTM MALDI-TOF MS对实验菌株进行鉴定和药物敏感试验；采用纸片法和最低抑菌浓度(MIC)法对实验菌株进行MRSA初筛和确证试验；采用基因扩增法对MRSA进行mecA 基因扩增及SCCmec基因分型。结果：65株初筛阳性的MRSA菌株，经PCR基因扩增后全部携带mecA基因。5种型别SCCmec分型结果：SCCmecⅠ(产物大小 613bp )无阳性；SCCmecⅡ(产物大小398bp)阳性菌株7株：标本号分别为20、27、29、31、33、52、53；SCCmec Ⅲ(产物大小280bp)阳性菌株16株：标本号分别为1、2、7、8、10、12、19、23、26、30、32、34、38、41、47、54； SCCmec IVa(产物大小 776bp)阳性菌株1株：标本号为20。SCCmec Ⅳb型(产物大小493bp)、SCCmec Ⅳc (产物大小200bp) 、 SCCmecⅣd (产物大小881bp )和 SCCmec V (产物大小 325bp) 扩增后均无阳性菌株。结论：65株MRSA均表现为多重耐药，其中对青霉素、苯唑西林和头孢西丁全部耐药；对万古霉素和利奈唑胺全部敏感。65株MRSA 全部携带mecA 基因。SCCmec基因型以SCCmec Ⅲ型为主，其次是SCCmec Ⅱ型和SCCmec Ⅳa型。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；基因扩增；SCCmec基因型别

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是人类主要致病菌之一，MRSA菌株是由对甲氧西林敏感的葡萄球菌逐渐演变而来，其耐药形成主要是原来的敏感菌株获得了携带mecA基因染色体mec基因盒(SCCmec)的耐药基因[1]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌克隆株可以根据SCCmec种类和基因型别分类[2]，对分离于医院和社区的MRSA菌株进行基因分型，可以为流行病学研究和合理使用抗生素提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2012 ～2012 年从山西大医院常规鉴定为金黄色葡萄球菌的菌株65株。所有菌株均分离于门诊或住院患者各类临床标本，其中包括痰液、血液、脓液、脑脊液、引流液、分泌物等。所有实验菌株为非重复性菌株，去除临床信息不全后的35研究菌株，采用实验室传统方法进行鉴定和MRSA初筛试验。实验确认的MRSA再经DNA提取和相应MRSA基因扩增检测确证。质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213均购自国家卫计委临床检验中心。

1.1.2 仪器和试剂 Vitek-2 compact 及配套的革兰阳性鉴定卡(GP)购自法国Bio Merieux 公司， Micro2flexTM MALDI-TOF MS 仪购自：美国布鲁克公司；聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)仪购置伯乐公司；凝胶成像仪：伯乐公司；DNA 测序仪使用上海生物工程公司产品；显微镜；主要试剂：基因测序扩增试剂盒购自上海生物工程公司；巧克力平板、羊血平板、伊红美蓝平板购自天津金章生物制品公司；革兰染液，触媒试剂； 血浆凝固酶试剂；头孢西丁、苯唑西林药敏纸片等购置于法国梅里埃生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌鉴定和MRSA 筛选与确证试验 采用M-H纸片扩散法、MIC 法对金黄色葡萄球菌菌株进行 MRSA 筛选和确证。质控菌株为分别为金黄色葡萄球菌 ATCC29213和ATCC25923，作为阴性和阳性对照菌。

1.2.2 金黄色葡萄球菌初步鉴定和MRSA初筛试验 试验程序根据美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS) 推荐的鉴定和药敏方法进行。

1.2.3 MRSA表型确证试验 用苯唑西林E-test MIC试纸条测定待测菌株的MIC，如 MIC ≥ 4μg/mL即判为 MRSA。

1.2.4 MRSA基因扩增 mecA基因和SCCmec基因型别扩增；引物由山西赛奥生物科技有限公司合成，mecA基因扩增电泳图(2% agarose electrophoresis)所用引物序列、产物大小、反应体系、扩增条件及凝胶成像，见表1。

表1 实验所用部分引物序列及扩增产物大小

1.2.5 PCR反应体系 25μL反应体系包括DNA模扳1.5μL； F- Primer (10μM)1.0μL； Primer-R(10μM) 1.0μL；2.5mM dNTPs2.0μL；GC enhance 1.5μL；10×Buffer 2.5μL；TaqDNA(5U/μl)0.4μL。加ddH2O 15.1μL补充至总反应体系为25μL。

1.2.6 PCR反应条件 94℃ 预变性5min，94℃ 变性 30 s，53℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s， 变性、退火 、延伸35个循环周期，72℃再延伸10 min，4℃保存。

1.2.7 电泳及成像 扩增产物电泳上样之前，用0.5×TBE电泳缓冲液充分浸泡凝胶，然后再将子量大小为1 000 bp的分子量标记(DNA Marker)加到上样孔中，将10μL P产物与2μL Loading Buffer充分混匀后，上样到含EB的1%琼脂糖凝胶的上样孔中，将上样产物端凝胶置于电源负极，接通电源，稳压60V，电泳60 min。电泳结束后，于凝胶成像系统下成像并保存记录图像。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌鉴定结果

MicroflexTM MALDI-TOF MS对金黄色葡萄球菌的鉴定率为 100%；Vitek-2 Compact对葡萄球菌的鉴定率为97.14%。66株实验菌株中，65株鉴定为金黄色葡萄球菌，一株鉴定为溶血葡萄球菌。

2.2 MRSA表型初筛和确证结果

采用苯唑西林(OX)和头孢西丁(FOX)纸片扩散法检测MRSA初筛试验，65株实验菌株全部阳性；采用苯唑西林E-test MIC试纸条检测实验菌株的MIC，确证MRSA，65株实验菌株全部阳性。

2.3 MRSA分离菌株药物敏感试验结果(见表2)

表2 65株MRSA对常用抗菌药物的药物敏感试验结果

2.4 MRSA分离菌株mecA 基因扩增结果

65株实验菌株mecA 基因扩增全部阳性，采用引物为mA1, 扩增基因为mecA, 扩增产物片段大小为 286bp, 条带长度与预期片段产度一致，其序列位于基因库中AB033763的32433-32453bp。扩增产物见图1。

图1 MRSA分离菌株mecA 基因扩增结果

注：mecA基因扩增电泳图(1% agarose electrophoresis)Lane M: 2kb DNA Maker; Lame1-65: mecA gene-positive amplification products, size 286bp。M: 1kb DNA Maker; Lame1-51: mecA products size 286bp。 扩增阳性标本：1-65号标本

2.5 SCCmec TypeI、SCCmec TypeII和SCCmec TypeIII型SCCmec基因分型结果(见图2～4)

图2 mecA分型中SCCmec Type I、SCCmec TypeII、SCCmec TypeIII型基因分型结果

注： I型 产物大小 613bp 扩增阳性：无阳性； II型 产物大小398bp 扩增阳性：20、27、29、31、3352、53；III型 产物大小280bp扩增阳性:1、2、7、8、10、12、19、23、26、30、32、34、38、41、47、54。

图3 mecA分型中SCCmec Type IV型基因分型结果

基因型： IVa型 产物大小 776bp 扩增阳性：20；IVb型 产物大小493bp 扩增阳性：无阳性；IVc型 产物大小200bp扩增阳性: 无阳性; IVd型 产物大小881bp 扩增阳性：无阳性。

图4 mecA分型中SCCmec Type V型基因分型结果

3 讨论

本研究显示MRSA对β-内酰胺类抗菌药物耐药的同时，对氨基糖苷类、林可霉素、氯霉素、大环内酯类及喹诺酮类等抗菌药物的敏感性也呈明显下降趋势。由于耐药率不断增加、耐药谱迅速扩大，准确鉴定金黄色葡萄球菌、对其耐药基因MRSA 进行检测具有非常重要的意义。

金黄色葡萄球菌为临床常见的病原菌，具有较强的致病力，可以引起皮肤软组织感染、血流感染及全身各脏器感染。据国内外报道，金黄色葡萄球菌引起的感染中，MRSA 占到约40%～80%[3]。我国多个医院监测结果显示MRSA的临床分离率呈上升趋势，检出率52%～68%，甚至高达84.4%[4]。MRSA治疗难度大，病死率高，已成为医院感染中的严重问题。

甲氧西林耐药的金葡菌都携带有mecA基因，但其耐药程度却不一致，MecA基因位于一个可移动的元件上，被称为金黄色葡萄球菌染色体基因盒SCCmec。通过多位点序列分型，已经确定了8个SCCmec基因型[3]。医院获得性感染耐甲氧西林金葡菌(HA-MRSA)通常是耐药菌株携带SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型，而社区获得性耐甲氧西林金葡萄菌(CA-MRSA)感染通常是Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ型。

本研究数据显示，65株初筛阳性的MRSA菌株经PCR基因扩增后全部携带mecA基因。5种型别SCCmec分型结果以SCCmec Ⅲ型为主(产物大小280bp)，阳性菌株16株。其次为SCCmecⅡ型(产物大小398bp)，阳性菌株7株。SCCmec Iva型(产物大小 776bp)阳性菌株1株。 SCCmecⅠ型、SCCmecⅣb型(产物大小493bp)、SCCmec Ⅳc (产物大小200bp) 、SCCmecⅣd (产物大小881bp )和 SCCmec V (产物大小 325bp) 扩增后均无阳性菌株。确证为MRSA，但无SCCmec分型扩增产物的菌株，推测可能为高产β-内酰胺酶有关，有待进一步研究证实。

研究耐药基因的表达水平与抗菌药物之间的关系，有利于从分子生物学水平阐明细菌耐药机制。对于MRSA感染发展新的抗菌药物主要障碍是需要明确新的分子靶点。同时，现存的有效对抗MRSA的抗菌药物类别提供了一系列的对于大多数MRSA感染的治疗方式。金黄色葡萄球菌可能会产生对于耐药基因的所有抗菌药物的耐药性。因此，其鉴定与研究可以为感染诊断和有效治疗方法提供科学依据。

[1] Y. Katayama,T. Ito,K. Hiramatsu. A New Class of Genetic Element,Staphylococcus Cassette Chromosome Mec(SCCmec), Encodes Methicillin Resistance in Staphylococcus Aureus[J].Antimicroblal Agents and Chemotherapy,2000，44：1549-1555.

[2] Shore. A., A. S. Rossney, C. T. Keane, et al. Coleman.Seven novel variants of the staphylococcal chromosomal cassette mec in methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from Ireland.Antimicrob[J].Agents Chemother,2005，49:2070-2083.

[3] Bouchei HW, Corey GR. Epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Clin Infect Dis, 2008, 46: 344-349.

[4] Consolidating and Exploring Antibiotic Resistance Gene Data ResourcesJ[J].Clin. Microbiol，2016，54(4):851-859.

本文编辑：王知平

山西省科技厅基础研究项目 (2013011060-1 )

周永年，男，副主任技师，从事临床检验工作

戎建荣，男，主任技师，硕士生导师，E-mail：13593181596@163.com

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1671-0126(2017)03-0019-04