浅谈甲基化抑制剂5-Aza-CdR对肺癌A549细胞株DNA甲基转移酶1及c-myc、MKi-67、p53基因表达的影响*

彭 峰，彭奕华，张宏华

（韶关市粤北人民医院呼吸内科，广东 韶关 512026）

近年来，肺癌的发病率逐年上升，严重地威胁到了人们的健康生活，作为一种常见的恶性肿瘤，其中的病因还没有完全明确，其中的发展变化涉及的是一个多阶段的复杂过程[1]。在肺癌发生的过程中，只要涉及的环节有抑癌基因的活性降低、癌基因的表达变得活跃、DNA的修复基因缺失，任何一个环节都有可能造成肺癌的发生，研究发现[2]：发生肿瘤的主要的原因是基因启动子区域的甲基化过程发生了异常的变化，甲基化修饰出现异常的情况时，基因的表达、细胞的分化及繁殖都会出现异常，严重的威胁到了人们的正常生活。

本文主要研究了甲基化抑制剂5-氮杂-2'脱氧胞苷 (5-Aza-CdR)对肺癌A549细胞株DNA甲基转移酶1(DNMT1)及c-myc、MKi-67、p53基因表达的影响，其中采用的是分组对比的研究方式，通过研究发现采用甲基化抑制剂5-Aza-CdR可以降低肺癌A549细胞中的DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表达量，升高p53基因的表达量，其中具体的数据分析如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

在进行研究的过程中选取肺癌A549细胞株作为主要的研究对象，所用到的材料有甲基化抑制剂5-Aza-CdR，采用的培养基为1640，采用的引物主要有：

DNMT1：上游5’ ATCTAGCTGCCAAACGGAGG-3’

下游5’ CTGAATGCACTTGGGGAGGGT-3’，191 bp；c-myc：上游5’ TACAACACCCGAGCAAGGAC-3’

下游5’ TTCTCCTCCTCGT-CGCAGTA-3’，259 bp;MKi-67：上游5’ ACACTCCACCTGTCCTGAAG-3’

下游5’ AG-GCAGGTTGCCACTC-TTTC-3’，251 bp;p53：上游5’ TCTTGTTCCCCACTGACAGC-3’

下游 5’ GTGCAG-GCCAACTTGTTCAG-3’，159 bp;β-action：上游5’ TGGCACCCAGCACAATGAA-3’

下游5’CTAAGT-CATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，186bp;SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，DNMT1 及 c-myc、MKi-67、p53 单克隆抗体及二抗。

1.2 方法

1.2.1 A549细胞株的培养及传代：在对A549细胞株进行培养的过程中，选取的培养液为浓度是10%的胎牛的血清1640培养溶液，放入适宜的环境中对肺癌A549细胞株进行培养。在培养的细胞群中选择细胞的汇合率达到了75%左右的细胞，对与贴壁紧密并且牢固的细胞优先选择，保证细胞处于一个良好的生长状态，这样可极大的保证传代细胞的质量，传代的过程中，结合实际的情况选择的时间为3d左右，将最终操作完成的传代细胞进行收集，一部分为观察组使用，另一部分为对照组，在观察组中加入5-Aza-CdR，其中的浓度为5μmol/L，对照组不加入任何药物。

1.2.2 采用FQ-PCR对mRNA的表达进行检测：将合成的cDNA作为模板，并且按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ说明书上的内容进行操作，其中引物上游为0.8 μL，下游为ROX Reference Dye（50×）0.40 μL，其中 cDNA 模板 2 μL，ddH2O 6 μL，扩增参数为 95℃ 30 min；95℃ 5 s；60℃ 30 s，在循环结束之后进行荧光采集检测。

1.2.3 检测蛋白表达：对蛋白的浓度进行检测，主要采用的是蛋白裂解液，并且进行电泳、转膜，需要的时间大约为1h左右，封闭放入温室后进行孵育工作，并进行显色及曝光的处理。

1.3 统计学方法

各个实验进行独立重复的三次操作，统计学软件SPSS16.0分析数据，计量资料利用均数±标准差（±s）表示，组间比较行t检验。

2 结果

2.1 A549细胞株的培养及传代

对两组的细胞进行药物处理3d之后，观察两组细胞的生长情况，研究发现观察组的细胞生长受到明显的抑制，具体的数据分析如表1。

表1 两组DNMT1及c-myc、MKi-67、p53表达量对比（±s）

表1 两组DNMT1及c-myc、MKi-67、p53表达量对比（±s）

项目mRNA组别观察组对照组tP--DNMT1 0.32±0.01 1.03±0.05 82.377 c-myc 0.32±0.02 1.01±0.02 144.324 p53 1.56±0.03 0.85±0.07 22.528＜0.05 MKi-67 0.25±0.01 0.97±0.02 190.494

2.2 两组细胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表达

通过研究发现观察组的DNMT1及c-myc、MKi-67的蛋白表达量明显的低于对照组，p53蛋白表达量明显高于对照组，具体的数据分析如表2。

表2 两组细胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表达（±s）

表2 两组细胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表达（±s）

项目蛋白组别观察组对照组t P--DNMT1 0.42±0.02 1.20±0.05 85.689 c-myc 0.43±0.02 1.30±0.10 4.678 p53 1.90±0.05 0.71±0.01 138.068＜0.05 MKi-67 0.32±0.02 0.50±0.08 12.917

3 讨论

作为一种DNA的甲基转移酶抑制剂，5-Aza-CdR能够迅速的与DNA的甲基转移酶进行结合，使得酶的活性降低，通过降低甲基化的水平来对基因的表达进行调整，因此在由于启动子甲基化造成的基因表达的不充分甚至缺失的疾病中，经常采用5-Aza-CdR来进行治疗[3]。c-myc是一种可异位基因，同时也是myc基因家族中的核心组成部分，它是一种可调节的基因，主要作用使细胞进行不断的生长、繁殖，并且可以促使细胞分裂，与肿瘤的发生有着密切的关系，该基因在正常的细胞转为癌细胞的过程中起着重要的作用[4]。MKi-67作为一种核抗原与增殖细胞有着密切的关系，如细胞的有丝分裂，在繁殖的过程中必不可少，该细胞的表达范围除了G0期以外的各个周期的细胞，成为了判断细胞增殖活性的重要的指标，该蛋白是唯一一个与细胞的周期及增殖活动相关的蛋白。大量的临床试验研究表明[5]，DNMTI在癌细胞中起着很重要的作用，DNMT1作为DNA甲基转移酶的主要的部分，可以对DNA进行复制及修复，它不仅对DNA甲基化的关键酶起着催化的作用，而且还有很好的维持DNA甲基化的作用。一般发生癌变肿瘤的原因是，DNMTI的表达增强，致使患者体内的抑癌基因CpG导致DNA异常甲基化，使其不能正常的表达，最终发生癌变。一般在胃癌、肺癌以及卵巢癌中DNMTI的表达最高，并且可以作为癌变基因的一个重要诊断依据[6]。P53也属于人体中的抑癌基因，它有着转灵激活的作用，这种基因如果失活很可能会形成肿瘤，并且它是目前临床上公认的抑癌基因之一，应该引起关注[7]。

本文研究的主要内容是甲基化抑制剂5-Aza-CdR对肺癌A549细胞株DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表达的影响，采用分组对照的方式进行研究，观察组细胞中采用5-Aza-CdR药物处理，对照组中不采用任何药物处理，通过一段时间的处理之后研究发现，观察组的细胞生长受到的明显的抑制，并且观察组中的DNMT1及c-myc、MKi-67的蛋白表达量明显的低于对照组，p53蛋白表达量明显高于对照组，主要的作用机制大概是5-Aza-CdR一方面是使得细胞发生了去甲基化[8]，另外一方面可能是甲基化等到了抑制，癌基因的表达不再活跃，使得抑癌基因的表达更加充分，加速了肿瘤细胞的凋亡，并且使得肿瘤细胞的繁殖率明显的降低，肿瘤细胞的负调控机制不断的加强，与此同时激活了抑癌基因的表达，从而有效控制肿瘤基因的表达[9]。其中研究还发现[10]，DNA甲基转移酶1以及c-myc、MKi-67、p53都是肺癌发生的关键因子，任何一种因子的表达发生异常情况时，都有可能促使肿瘤的生长及繁殖，5-Aza-CdR通过控制基因启动子区的过度甲基化，从而控制肿瘤的进一步的恶化[11]。

综上所述，甲基化抑制剂5-Aza-CdR明显的降低了肺癌A549细胞中的DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表达量，使得p53基因表达量升高，抑制了癌基因的表达，使得肿瘤细胞的生长得到有效的控制，为采用去甲基化的方式进行治疗肺癌提供了有力的依据[12]。

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