小鼠胚胎神经干细胞的分离及贴壁培养方法*

杨骐昌， 宋晓峰， 韩 平

1南京航空航天大学生物医学工程系，南京 2111002南京医科大学第一附属医院产科，南京 210005

小鼠胚胎神经干细胞的分离及贴壁培养方法*

杨骐昌1， 宋晓峰1， 韩 平2△

1南京航空航天大学生物医学工程系，南京 2111002南京医科大学第一附属医院产科，南京 210005

目的 探索一种改进的贴壁培养神经干细胞的方法。方法 从胚胎期为15.5 d的胎鼠大脑皮层中提取神经干细胞，在PO/FN(Poly-L-ornithine hydrochloride/Fibronectin)包被处理后的培养瓶中进行贴壁培养并传代，在倒置显微镜下观察神经干细胞的细胞形态，并通过免疫荧光法鉴定神经干细胞及其子代细胞进行分化操作之后的情况。结果 原代神经干细胞细胞形态清晰，免疫荧光标记物明显。结论 相对于传统神经球悬浮培养法该法处理简便，传代损耗低，容易观察到细胞形态和分化阶段，更有助于神经干细胞的培养和存储。

神经干细胞； 贴壁培养； 包被处理； 免疫荧光； 悬浮培养

神经系统是人体内起主导作用的功能调节系统，在神经系统的发育期间，神经干细胞(neural stem cells，NSCs)会向其他脑部区域迁移，并分化为特异性细胞[1]，提供了大量脑组织所需的细胞，其增殖与分化对神经发育起到至关重要的作用[2]。神经干细胞具有全能性和无限增殖的能力，可在体外培养、克隆、冻存及进行遗传操作[3]。对于神经干细胞的培养方法，经过长时间的探索与实验，形成了一套相对完整的培养体系——悬浮培养法[4]。悬浮培养法操作简便，在吹散神经干细胞球之后即可获得大量的细胞[5]。但是该方法存在不少缺陷，其中最为严重的是神经球内部的干细胞因为长时间接触不到培养液中的营养成分和抑制分化的营养因子，容易死亡或者分化[6]；此外，同处一个细胞球内的神经干细胞不一定是由单个细胞增殖来的，而是由数个细胞紧密结合在一起之后大量增殖的[7]。

本研究尝试并采用一种改进的神经干细胞培养方法——贴壁培养法，在培养神经干细胞之前对培养器皿进行多聚L鸟氨酸/纤维连接蛋白(Poly-L-ornithine hydrochloride，PO/FN)试剂的包被处理[8]。这种方法的原理在于模拟颅内神经干细胞的生活环境[9]，帮助神经干细胞粘附在培养器皿表面，从而避免了常规贴壁培养时因抱团过紧出现分化和死亡的现象[10]，培养操作与常规贴壁培养方法无异，同时能够清晰观测到细胞状态、数量。采用该方法培养的神经干细胞与培养液充分接触，纯度较高，很少发生细胞死亡或者分化的现象，能够为神经干细胞的进一步研究提供实验基础[11]。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.1.1 实验动物 选用由南京医科大学实验动物中心提供的6～8周龄的C57BL/6J小鼠，体质量均为20 g以上，同笼雌雄比为3∶1，第1天合笼记为0.5 d。对动物处置方法符合动物伦理学要求。

1.1.2 主要试剂及来源 DMEM/F12 1∶1培养液、B27培养液、小鼠碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、PO试剂、FN试剂、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、P/S(Penicillin-Streptomycin)双抗、D-Hank’s溶液均购自Gibco公司；Nestin鼠单克隆抗体、山羊抗小鼠抗体FITC、GFAP兔克隆抗体、山羊抗兔抗体Cy3均购自Abcam公司；细胞消化液购自ACCUTASE公司。

1.1.3 培养液配方 NSCs培养液的成分为：1 mL B27+1 250 ng b-FGF+50 mL DMEM/F12(1：1)+ P/S。分化培养液的成分为：1 mL B27+50 mL DMEM/F12(1：1)+1 mL FBS+P/S。冻存液的成分为：5 mL DMSO+50 mL DMEM/F12(1：1)+1 mL B27+P/S。

1.2 神经干细胞的培养

实验于2014年7月至2015年8月在江苏省人民医院生殖中心实验室完成。

1.2.1 PO/FN 包被处理 培养瓶(皿)第1天：用去离子水稀释PO试剂，然后以100 μL/孔铺96孔板，以0.5 mL/孔铺24孔板，以2 mL/孔铺6孔板，以4 mL/孔铺25 cm2塑料培养瓶，以5～8 mL/孔铺10 cm培养皿，在37℃培养箱中过夜处理。第2天：首先用去离子水清洗器皿2次；用PBS稀释FN试剂，加入同PO试剂的量于器皿中，于室温中静置超过1.5 h；再用去离子水清洗2次即可使用。可于4℃条件保存1个月。PO试剂和FN试剂可提前稀释并分别存储于-20℃和4℃环境下，实验前在常温下解冻。

1.2.2 神经干细胞的制备 将C57孕鼠(孕15.5 d)脱颈椎处死，取胎鼠，将胎鼠依次用0.1%新洁尔灭、75%乙醇浸泡；在无菌环境下，取胎鼠大脑皮层并用D-Hank’s液洗2遍；将脑组织转移到装有7 mL D-Hank’s液的玻璃皿中进行剥除脑膜处理；用弯剪将剥去脑膜的脑组织剪碎；用5 mL D-Hank’s液冲洗弯剪和玻璃皿上残留的脑组织；将剪碎的脑组织碎片转移至小烧杯中，加入2 mL D-Hank’s液，用5 mL的微量移液器吹打(不多于10次)；将含有脑组织的D-Hank’s液转移到15 mL离心管中，于1 000 r/min下离心4 min；离心后，弃去上清液，加入2 mL NSCs培养液于离心管中，吹打细胞团块；用400目的筛网滤过混匀的神经干细胞；从滤过的神经干细胞母液中吸取100 μL，加900 μL的神经干细胞培养液稀释10倍后计数细胞；按照每个培养瓶(底面积25 cm2)106个/mL的密度进行接种，用NSCs培养液进行培养。6 d后换瓶传代，贴壁细胞的传代采用无需血清中和的ACCUTASE细胞消化液进行消化，每培养瓶加入4 mL细胞消化液后放入培养箱中消化5～10 min，随后收集细胞液于15 mL离心管中，在离心机中以1 000 r/min离心4 min之后，弃去上清；加2 mL神经干细胞培养液于离心管中，用1 mL的微量移液器轻柔吹打约30次，使细胞球尽量分散开；补齐培养液至5 mL/瓶；重新接种在经过PO/FN处理的玻璃培养瓶中，置培养箱中继续培养。

1.2.3 神经干细胞的培养及传代 贴壁细胞每3天更换NSCs培养液1次。培养细胞密度达到70%左右时进行传代处理(约上一次传代操作后8 d)，用ACCUTASE细胞消化液进行消化，每培养瓶加入4 mL细胞消化液后放入培养箱中消化5～10 min，随后收集细胞液于15 mL离心管中，在离心机中以1 000 r/min离心4 min后，弃去上清，加入NSCs培养液以1∶3重新种植于经PO/FN包被的新培养瓶中。

1.2.4 神经干细胞的冻存 细胞消化液消化细胞，放入培养箱消化10 min后，加入少量培养液轻轻吹打瓶底，收集细胞液于15 mL离心管中，在离心机中以1 000 r/min离心4 min，去上清，避光条件下加入冻存液放入冻存管中，保存于-80℃环境下2～3 d，最后于液氮罐中长期保存。

1.2.5神经干细胞的复苏 将冻存管从液氮罐中取出后，迅速移至水浴锅中，在37℃水浴中不断晃动冻存管，完全溶化后迅速转移至15 mL离心管中并加入4倍体积的培养液反复吹打，之后以1 000 r/min离心4 min，去上清再加入神经干细胞培养液重新悬浮，再以适当浓度种植于已经PO/FN包被处理的培养瓶中。

1.3 神经干细胞及其分化细胞的鉴定

细胞消化液消化细胞，放入培养箱消化10 min后，加入少量培养液轻轻吹打瓶底，收集细胞液于15 mL离心管中，在离心机中以1 000 r/min离心4 min，弃去上清重悬，用细胞计数板计数，以1×105的密度接种在含有小玻片的24孔板中，加入NSCs培养液或者分化传代液，培养6 d后，选用神经干细胞标记物Nestin和星形胶质细胞标记物GFAP对神经干细胞及其分化细胞按照以下实验方法进行免疫抗原染色。

用4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，用含5%牛血清白蛋白(BSA)的封闭液(含0.2%Trition X-100)室温封闭1 h后，加入小鼠单克隆Nestin抗体(1∶100)以及兔多克隆GFAP抗体(1∶100)，4℃冰箱过夜；PBS漂洗3次，每次5 min，加入FITC标记的山羊抗小鼠二抗(1∶400)以及Cy3标记的山羊抗兔二抗(1∶400)，避光37 ℃反应1 h，PBS漂洗5 min×5次，接着用Dapi染色，室温15 min，PBS漂洗5 min×3次，最后封片液封闭玻片，在荧光显微镜下观察、拍照。可保存于-20℃达2个月。

2 结果

2.1 原代及传代小鼠神经干细胞的形态学特征

刚提取的小鼠神经干细胞在倒置显微镜下大多以单个细胞的形态显示，呈现椭圆形或者圆形，折光性较好且没有细胞突起。培养6 d后，在培养瓶的底部有大量碎渣样细胞死亡，需要传代换瓶。传代操作后4 d，部分悬浮的神经干细胞贴壁，细胞形态由原先的椭圆形或者圆形变为两极或者三极形态，培养到6 d后细胞贴壁数量激增，且自身开始大量增殖，8～9 d后细胞数量达到传代需求，可以进行传代处理，10 d后细胞过于拥挤，不适于神经干细胞的生长。图1为换瓶传代后在NSCs培养液中贴壁培养6 d的神经干细胞在倒置相差显微镜下的细胞形态与特征，放大倍数为200倍，从图中我们可以看到神经干细胞吸附在培养瓶表面并伸展突触，可以十分明晰地观测到神经干细胞的多种形态以及聚集情况。若因操作不当或者其他原因导致细胞分化、死亡或聚集过密时，我们也能用倒置显微镜观察到并及时进行相应处理，以减少对后续实验的影响和干扰。

2.2 NSCs及其诱导分化的鉴定

未成熟神经元和胶质细胞的标志蛋白Nestin常被用于判断NSCs，本实验方法分离和贴壁培养的神经干细胞Nestin表达呈现阳性，说明其具有神经前体细胞的特性。因为神经干细胞需要一些时间贴壁并展开突触，我们选择贴壁培养5 d左右的神经干细胞做分化实验，加入分化培养液促进神经干细胞的分化。在分化后2 d少量神经干细胞开始出

现突触增长变宽，4 d后分化细胞数量增加，6 d后大多数神经干细胞分化为神经元和神经胶质细胞，10 d后开始出现突触断裂，分化细胞死亡的现象。同时我们还选择神经干细胞标记物Nestin和星形胶质细胞标记物GFAP对神经干细胞及其分化细胞进行细胞鉴定，分别对未分化、分化2、4、6 d的神经干细胞进行免疫荧光鉴定(图2)。本研究采用多重染色法免疫荧光标记处理细胞，即绿色的Nestin染色神经干细胞、橙红色的GFAP染色神经胶质细胞和蓝色的Dapi染色细胞核，进而在荧光显微镜下可以观测多种标记在同一个细胞视野中的效果。从图2A中我们可以看到在未分化的神经干细胞中只有明显的Nestin阳性，并无GFAP的免疫荧光现象；而分化2 d之后(图2B)，大部分细胞仍呈现Nestin阳性，但是出现部分GFAP阳性，GFAP呈现阳性的细胞突触较短，荧光强度也比较弱；进而在图2C中，神经干细胞进一步分化，GFAP呈现阳性的细胞数量和强度相对于之前都有升高；而在分化6 d之后(图2D)，图中大部分细胞都呈现GFAP阳性，突触的长度和数量较之前也明显增加，Nestin的免疫荧光强度已明显低于GFAP的荧光强度，因此显得较少且暗，说明神经干细胞因分化而数量不断减少，而分化细胞逐渐增多并表达强烈。

图1 倒置相差显微镜下的神经干细胞(×200)Fig.1 Morphology of the neural stem cells under inverted microscope(×200)

A：未分化细胞；B：分化2 d后细胞；C：分化4 d后细胞；D：分化6 d后细胞；白色标尺长度为20 μm；绿色的Nestin染色神经干细胞，橙红色的GFAP染色神经胶质细胞，蓝色的Dapi染色细胞核图2 神经干细胞及其分化细胞的免疫荧光鉴定Fig.2 Immunofluorescence identificaiton of NSCs and the differentiated cells

2.3 贴壁培养与悬浮培养的比较

我们分别采用改进的贴壁培养方法和传统的悬浮培养细胞球的方法悬浮培养神经干细胞，两组细胞同时采用NSCs培养液进行细胞培养和筛选，在NSCs培养液中培养6 d后分别进行细胞计数，并以1×105的密度接种在含有小玻片的24孔板中，两组细胞唯一的区别在于改进组的培养瓶和小玻片都进行了PO/FN的包被处理，而传统组没有进行包被处理。之后两组细胞同时加入分化培养液进行分化催化，并在分化6 d之后同时用免疫荧光技术对其进行细胞鉴定(图3)。在图3A和图3B的对比中，我们可以在前一张图中清晰观测到神经干细胞的细胞形态、数量和聚集情况，而在后一张图中却难以观测到这些具体信息，只能对其进行大体估摸。进而在图3C和图3D中，我们分别对2种培养方法的神经干细胞进行了催化分化，在分化6 d后进行免疫荧光鉴定，在图中我们可以在前者观测到细胞的形态、数量、突触的长度和数量，甚至可以观测到Nestin的阳性表达，而在后者，我们几乎无法辨别细胞的数量，因大部分呈现GFAP阳性从而无法观测到其他的免疫荧光反应。从图片中我们可以比较2种培养方法在观测细胞形态、数量、分化状态时的差异。此外，传统的悬浮培养细胞球的方法由于过近的生长距离和内部紧密的结合容易引发细胞的死亡从而表现出球体内部发黑，同时在吹散细胞球的同时容易造成细胞的死亡和损失。图4所示为倒置相差显微镜下40倍率的悬浮细胞球形态，部分细胞球因分化粘附于瓶底，部分细胞球内部细胞死亡从而发黑，不利于后续实验的进行。在图5A中，可以从形态上看出细胞球由于细胞间距离紧密而无法分辨细胞状态，而在图1和图5B中可以看到，本研究采用的改进方法能很好地避免这些现象的出现，可以清楚观测到细胞形态与分化阶段。

A：采用PO/FN包被处理培养器皿贴壁培养法培养的未分化细胞的免疫荧光；B：采用传统悬浮神经干细胞球培养法培养的未分化细胞的免疫荧光；C：采用PO/FN Coating处理培养器皿贴壁培养法培养的分化6 d后细胞的免疫荧光；D：采用传统悬浮神经干细胞球培养法培养的分化6 d后细胞的免疫荧光；白色标尺长度为20 μm；绿色的Nestin染色神经干细胞，橙红色的GFAP染色神经胶质细胞，蓝色的Dapi染色细胞核图3 PO/FN Coating处理培养器皿贴壁培养法与传统悬浮神经干细胞球培养法的比较Fig.3 Comparison between PO/FN coating method and traditional method

图4 传统悬浮神经干细胞球培养法培养6 d后在倒置显微镜下的神经干细胞球(×40)Fig.4 Morphology of neural stem cells after 6 days’suspension culture under inverted microscope(×40)

3 讨论

神经干细胞是一种具有自我增殖并且多向分化潜能的前体细胞，目前，神经干细胞大多采用无血清的基础培养液悬浮培养神经干细胞球的培养方式。悬浮培养虽然简便易行，但是难以观察细胞的形态和个数，过近的生长距离、内部紧密的结合容易引发细胞的死亡和分化[12]。

A：采用传统悬浮神经干细胞球培养法分化培养10 d后在倒置显微镜下的细胞形态；B：采用PO/FN包被处理培养器皿贴壁培养法分化培养10 d后在倒置相差显微镜下的细胞形态图5 传统悬浮神经干细胞球培养法与PO/FN Coating处理培养器皿贴壁培养法分化培养10 d后在倒置显微镜下的细胞形态(×100)Fig.5 Morphology of the cells under inverted microscope after 10 days’culture by PO/FN coating method and traditional method(×100)

本实验中采用了Nestin抗体和GFAP抗体对细胞进行鉴定。未成熟神经元Nestin是细胞的骨架蛋白，主要在神经干细胞中表达，并且随着神经干细胞逐渐成熟和分化潜能的丧失，Nestin的表达也会随之减弱甚至消失，所以Nestin常被用于神经干细胞的检测与鉴定[13]。星形胶质细胞标记蛋白GFAP是人体脑内数量极为庞大的细胞类型之一，主要存在于星形胶质细胞内，与神经元紧密相邻并充斥于神经元及其突起之间，同时对神经元起到营养支持和保护缓冲的作用，此外，星形胶质细胞在神经系统发育、正常生理活动和病变过程中也有重要作用[14]。通常研究者会分别对神经干细胞、神经胶质细胞及神经元细胞荧光标记，进而对神经干细胞及其分化产物鉴定，但是本研究为了说明改进方法在细胞观察和鉴定方面的优势，采用多重染色法免疫荧光标记处理细胞[15]，除了必要的Dapi和Nestin染色外，只能从神经胶质细胞和神经元细胞中选一种细胞进行染色。本文选用神经胶质细胞而非神经元细胞是因为神经胶质细胞是支撑和保护神经元细胞的基础，实验证明敲除神经胶质细胞中的GFAP之后，神经元和神经胶质细胞的突触停止伸展并逐渐萎缩[16]。此外，神经胶质细胞对于颅内微环境的稳定和神经系统的发育同样有着不可或缺的作用[17]。本文采用Nestin抗体和GFAP抗体对神经干细胞及其分化产物进行鉴定，并以此说明改进的贴壁培养法相对于传统悬浮培养方法的优越之处。

本实验中采用经过PO/FN包被处理的培养器皿贴壁培养神经干细胞。PO是一种人工合成的氨基酸链，广泛运用于促进细胞粘连剂的包被试剂，最近还有实验证明其对分化干细胞有促进成团的作用[18]。同时，PO试剂有助于促进细胞粘附到固体基质[19]，即增强细胞的贴壁率[20]。除此以外，PO试剂还能提高转染效率，为后续转染实验提供便利[21]。另外，我们采用FN试剂对培养器皿进行包被处理。FN能促进细胞的粘连生长[22]，使得机体结构得以维持，是细胞生长完成的必要条件[23]，还能缩短细胞生长时间[24]。

在培养液中营养因子的选择上，本实验选用B27作为神经营养添加剂，B27中含有必需脂肪酸、抗氧化剂、维生素等成分，是无血清培养液的理想添加剂[25]，同时相对于同样是神经细胞营养添加剂的N2，B27对于神经干细胞催化增殖的效果更好[26]。本实验还添加了能够促进细胞有丝分裂的生长因子bFGF，已有大量实验证实bFGF对神经干细胞增殖的早期阶段发挥促有丝分裂的作用，能够促进神经干细胞的增殖[27]。

在传统悬浮培养过程中，经常出现神经干细胞球内发黑的现象，是因为球内细胞无法摄取培养液中的养分，继而死亡呈现出黑色。在图1中我们从细胞形态上可以看到单层培养细胞能够避免传统悬浮培养法中出现的细胞因无法摄取营养而死亡的现象，并且通过图2的免疫荧光鉴定可以证实贴壁细胞绝大部分呈现Nestin阳性，仍然保持未分化的状态，仍然为神经干细胞，促进目的细胞筛选和神经干细胞的增殖培养的同时，有效地抑制了神经干细胞的分化现象。当然，我们并未进一步实验验证这一结论，而仅从倒置显微镜下进行细胞形态的观察和比较，我们将在之后补充相关实验。

综上所述，本文中贴壁培养神经干细胞的改进方法较传统方法更易于观测到细胞的状态和数量，减少了细胞的死亡率和分化可能，能够为后续实验提供数量精准、状态良好的神经干细胞。

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(2016-09-06 收稿)

Isolation and Adherent Culture of Neural Stem Cells from Mouse Embryo

Yang Qichang1，Song Xiaofeng1，Han Ping2△

1DepartmentofBiomedicalEngineering，NanjingUniversityofAeronauticsandAstronautics，Nanjing211100，China2DepartmentofObstetrics,TheFirstAffiliatedHospitalwithNanjingMedicalUniversity，Nanjing210005，China

Objective To develop a modified method of adherent culturing NSCs to replace the traditional suspension culturing method.Methods Neural stem cells(NSCs)were isolated from brain of fetal mouse at 15.5-day fetal age.In culture bottle which had been pre-coated with poly-L-ornithine hydrochloride/fibronectin(PO/FN)，the cells were adherently cultured and passaged.The cell morphology was observed under inverted microscope.NSCs and their differentiated cells were identified by immunofluorescence.Results NSCs obtained in this study were successfully adherently cultured and expressed specific markers.Conclusion NSCs are successfully adherently cultured in this study.As compared with the traditional suspension culturing method，adherent culturing is simpler and has lower wastage of passage.It is easy to observe cell morphology and differentiation by this method.It is also helpful to culturing and storage of NSCs.

neural stem cells； adherent culture； coating process； immunofluorescence； suspension culture

*国家自然科学基金资助项目(No.81270700)

R329

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.015

杨骐昌，男，1991年生，博士研究生，E-mail：yqcxiaogui@sina.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：hanping200701@163.com