新乌头碱对K562细胞及耐柔红霉素的K562细胞凋亡的诱导作用及其机制*

关 心， 杨同华， 张超然， 冯 帅

云南省第一人民医院血液科，昆明 650032

新乌头碱对K562细胞及耐柔红霉素的K562细胞凋亡的诱导作用及其机制*

关 心， 杨同华△， 张超然， 冯 帅

云南省第一人民医院血液科，昆明 650032

目的 观察温阳药新乌头碱对白血病细胞K562和K562耐柔红霉素细胞株(K562/DNR)的抑制作用及可能的分子机制。方法 应用MTT法，结合流式细胞术检测不同浓度新乌头碱对K562和K562/DNR增殖和凋亡的影响。通过Real-time PCR检测不同浓度新乌头碱作用72 h对K562和K562/DNR细胞C/EBPα、Caspase-3、p53凋亡相关基因表达的影响。结果 K562和K562/DNR细胞的增殖抑制率随着新乌头碱浓度增加及作用时间延长而上升，呈浓度、时间依赖性(均P<0.05)。新乌头碱能引起K562和K562/DNR细胞凋亡，且随着药物浓度增加，凋亡率也逐渐升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。Real-time PCR结果显示，经50 μmol/L新乌头碱作用72 h，K562和K562/DNR细胞的C/EBPα表达下调，Caspase-3、p53表达上调，与正常对照组相比差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 新乌头碱能够引起K562和K562/DNR细胞发生凋亡，并且凋亡机制可能与下调C/EBPa基因及上调Caspase-3、p53基因有关。

新乌头碱； 白血病； 细胞凋亡； C/EBPα基因； Caspase-3基因； p53基因

近年来，世界各国的恶性肿瘤发病情况呈上升趋势，其中白血病的死亡率在恶性肿瘤中排名第6，在青少年肿瘤患者中死亡率排第1。中药附子具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功，为温阳中药。研究发现附子所含的乌头碱成分对肿瘤细胞生物大分子合成有抑制作用，可诱导肿瘤细胞分化、凋亡，近年有应用参附类针剂治疗白血病、骨髓增生异常综合征的报道[1]。同时，本研究前期发现温阳药物附子中的有效成分新乌头碱可使K562细胞的细胞凋亡发生改变，本实验将进一步探索新乌头碱对K562细胞及柔红霉素诱导的耐药K562细胞的作用机制，以期为血液系统恶性肿瘤的治疗寻找可能的新药。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞及实验试剂 K562细胞和K562耐柔红霉素细胞株(K562/DNR)(中国科学院昆明动物研究所)，RPMI 1640培养液(美国Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、Annexin Ⅴ-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)、PCR试剂盒(美国SYBR Green公司)、逆转录试剂盒(美国Thermo公司)、RNaseⅠ(Fermentas公司)、PCR引物(由上海捷瑞公司合成)，PI、DMSO等其他化学试剂为实验室常规试剂，新乌头碱标准品(成都曼斯特生物科技有限公司)。

1.1.2 实验仪器 FACSArial Ⅱ流式细胞仪(美国BD公司)、二氧化碳恒温培养箱(日本三洋公司，MCO-15AC)、单人单面净化工作台(SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司)、奥地利全自动定量酶标仪(Anthos仪器公司，Anthos 2010)、高速低温离心机(德国Heraens公司)、-180℃低温冰箱(日本三洋公司)、-30℃冰箱(海尔公司)、LightCycler 2.0 PCR仪(罗氏公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将细胞接种于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，在37℃含5%CO2的培养箱内培养传代，每2～3天换液1次。K562/DNR细胞在培养体系中加入浓度为0.6～0.8 μmol/L的柔红霉素以维持其耐药性，实验前检测细胞耐药性并无药培养2周。细胞培养每天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。锥虫蓝拒染法检测细胞活力。

1.2.2 细胞存活率测定 取活力98%以上的K562和K562/DNR细胞接种到96孔培养板。每孔反应体系为100 μL，细胞终浓度为5×103/孔。加入浓度为5、10、25、50、75、100 μmol/L新乌头碱，分别培养24、48、72 h，上酶标免疫测定仪检测，测定吸光度(A)值。以完全培养液为空白对照，含相应浓度的溶液为溶剂对照，比色时，以空白组调零。每个浓度每个时点设3个复孔。计算K562和K562/DNR细胞增殖抑制率，抑制率=(1-处理组A值/溶剂对照组A值)×100%

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集25、50 μmol/L新乌头碱作用的细胞于离心管中，制成单细胞悬液，用PBS洗2次，收集(1～5)×105个细胞。在细胞中加入500 μL的Binding buffer(固定液)混匀。样本管加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC混匀后，再加入5 μL PI混匀。室温避光反应5～15 min。在1 h内，上流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。实验重复3次。

1.2.4 Real-time PCR检测凋亡相关基因的表达 分别收集25、50 μmol/L的新乌头碱作用72 h的K562和K562/DNR细胞，按组提取总RNA，1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，在紫外分光光度仪(A260 nm/A280 nm)下测其浓度。按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit试剂说明书合成cDNA，RNA样品均取3 μg。向0.2 mL PCR管中顺序加入2 × PCR Master Mix(主要体系混合液)10 μL，PCR water nuclease-free(去核酸水)8 μL，目的基因上游引物0.3 μL，目的基因下游引物0.3 μL，逆转录模板1 μL。PCR反应条件：94℃预变性10 min；94℃变性45 s，退火1 min，72℃延伸45 s，40个循环；72℃总延伸15 min。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法对目的基因进行相对定量测定。本实验中涉及到的凋亡基因C/EBPα、Caspase-3、p53的引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 新乌头碱对K562及K562/DNR细胞的细胞毒作用

新乌头碱使细胞生存率降低，如表2、3所示，25、50 μmol/L的新乌头碱即可明显降低2种细胞的生存率，且呈浓度和时间依赖性。25 μmol/L的新乌头碱作用48 h对K562及K562/DNR细胞的增殖抑制率分别为(49.32±0.87)%和(39.55±0.13)%，作用72 h后2种细胞的增殖抑制率分别为(38.33±0.75)%和(27.34±0.37)%。

2.2 新乌头碱对K562及K562/DNR细胞凋亡的影响

选定25、50 μmol/L的新乌头碱处理K562及K562/DNR细胞72 h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率如表4所示。与不做药物处理的K562细胞及K562/DNR细胞进行比较，可见25、50 μmol/L的新乌头碱使细胞凋亡率增加，随着新乌头碱浓度的增加，凋亡细胞的比例也相应增加。

表2 新乌头碱对K562细胞的增殖抑制率

与对照组比较，*P<0.05

表3 新乌头碱对K562/DNR细胞的增殖抑制率

与对照组比较，*P<0.05

2.3 新乌头碱对K562及K562/DNR细胞凋亡相关基因表达的影响

Real-time PCR检测结果显示，与对照组相比较，25、50 μmol/L新乌头碱作用下K562细胞及K562/DNR细胞的C/EBPα基因表达明显下调，Caspase-3、p53基因表达明显上调，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表5。

表4 新乌头碱诱导72 h时K562及K562/DNR细胞的凋亡率

与对照组比较，*P<0.05

表5 新乌头碱对K562细胞及K562/DNR细胞凋亡相关基因表达的影响

与同种细胞对照组比较，*P<0.05

3 讨论

恶性肿瘤是危害人类生命和健康的最严重的疾病之一，某些中药具有抗肿瘤作用已得到公认[2-3]。近现代不少中医医家认为肿瘤的形成与阳虚感寒有关。《黄帝内经·瘙簚阴阳应象大论》：“阴阳者万物之纲纪，变化之父母，生杀之本始”、“阴阳者，万物之能始也”[4]。肿瘤在中医上多属于阴寒凝聚，阳盛则肿瘤不长[5]。附子为毛茛科植物乌头AcomitumcarmichaeliDebx的子根加工品，味辛甘、性大热，有毒，入心、肾、脾经，走而不守，有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功。依据现代药理研究，其起主要效应的成分就是含乌头碱类物质[6]。有研究以乌头类生物碱作用于体外培养的大鼠视网膜神经细胞证实，在乌头类生物碱作用下，ras基因的表达被抑制，进而使得细胞增殖过程被抑制[7]；还有研究发现乌头碱能够显著降低Pgp蛋白表达，逆转了肿瘤细胞多药耐药性[8]。

细胞凋亡或程序化细胞死亡，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡的过程。凋亡过程的紊乱，可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性变及局部损伤等[9]。本研究经过MTT实验证实了新乌头碱对K562细胞及K562/DNR细胞生长的抑制作用，Annexin Ⅴ/PI双染标记后流式细胞仪检测发现，新乌头碱能够诱导2种细胞发生凋亡，这是造成新乌头碱作用后细胞生存率明显下降的原因。同时，通过基因水平的分析，得出新乌头碱能够引起K562和K562/DNR细胞发生凋亡并且凋亡机制可能与下调C/EBPα基因的表达，上调Caspase-3、p53基因表达有关。其中增强子结合蛋白C/EBPα是髓系祖细胞增殖与分化过程中一个重要的转录因子，在诱导粒系分化和抑制细胞增殖方面起着重要作用，并通过多种机制参与粒细胞的生成，C/EBPα的促分化和抑制增殖作用使其可以作为一双向的靶分子用于肿瘤治疗和监测[10]。Caspases是一种特异性蛋白酶，正常情况下Caspases以无活性的酶原形式存在，在凋亡诱导信号作用下，通过蛋白水解去除氨基端的一段序列而被激活，激活的Caspases通过破坏DNA和细胞核结构诱导细胞凋亡[11]。p53基因具有诱导细胞凋亡、调控细胞周期、修复DNA损伤等重要功能，超过50%人类肿瘤、13%的血液系统恶性肿瘤中均存在p53基因的突变，p53基因异常与白血病的临床病程、预后转归等密切相关[12]，这些凋亡基因的异常及形成机制可能是白血病治疗的新契机。

肿瘤多药耐药(multi-drug resistance，MDR)已成为肿瘤治疗中面临的重大难题，MDR的客观存在是肿瘤化疗失败的主要原因，因此，寻找低毒高效的肿瘤耐药逆转剂已是肿瘤化疗药物研究领域的热点[13]。目前柔红霉素在诱导肿瘤细胞耐药过程中所涉及的具体机制以及相关的分子信号表达调控机制仍有待深入研究。本实验通过观察新乌头碱引起K562和K562/DNR细胞发生凋亡，进一步证明了温阳中药提取物抗白血病的作用机制，希望能为新乌头碱在临床肿瘤治疗中的应用提供依据。

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(2016-10-20 收稿)

Induction Effect of Mesaconitine on Apoptosis of K562 and K562/DNR Cells and Related Mechanism

Guan Xin，Yang Tonghua△，Zhang Chaoranetal

DepartmentofHematology，FirstPeople’sHospitalofYunnanProvince，Kunming650032，China

Objective To observe inhibitory effect of mesaconitine inWenYangherbs on leukemia K562 cells and K562 resistant daunorubicin cell line(K562/DNR)and possible molecular mechanism.Methods Effect of different concentrations of mesaconitine on proliferation and apoptosis of K562 and K562/DNR cells was detected by using MTT and flow cytometry.After treatment for 72 h，effect of different concentrations of mesaconitine on C/EBPα，Caspase-3 and p53 in K562 and K562/DNR cells was detected by real-time PCR.Results The proliferation of K562 and K562/DNR cells was significantly inhibited by mesaconitine in concentration- and time-dependent manner(P<0.05).Mesaconitine significantly induced apoptosis of K562 and K562/DNR cells，and the apoptosis rate was increased with increasing of mesaconitine concentration(P<0.05).Real-time PCR results showed that after treatment with 50 μmol/L mesaconitine for 72 h，C/EBPα was significantly decreased，Caspase-3 and p53 were significantly increased in K562 and K562/DNR cells as compared with the normal control group(P<0.05).Conclusion Mesaconitine can induce apoptosis of K562 cells and K562/DNR cells，and the underlying mechanism is related with downregulation of C/EBPα and upregulation of Caspase-3 and p53.

mesaconitine； leukaemia； cell apoptosis； C/EBPα gene； Caspase-3 gene； p53 gene

*国家自然科学基金资助项目(No.81160483)

R285.5，R979.14

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.008

关 心，女，1987年生，医学硕士，E-mail：61801064@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：ynanblood@aliyun.com