ADAM17对U87MG胶质瘤细胞增殖与侵袭的影响及作用机制

李 舜 唐晓平 冯 凌 唐文国 旷仁钊 赵 龙 王远传 彭 华 段 劼 罗仁国 杨彬彬 张 涛



ADAM17对U87MG胶质瘤细胞增殖与侵袭的影响及作用机制

李 舜 唐晓平 冯 凌 唐文国 旷仁钊 赵 龙 王远传 彭 华 段 劼 罗仁国 杨彬彬 张 涛

目的 探讨ADAM17在U87MG细胞增殖与侵袭中的作用及机制。方法 收集人脑胶质瘤组织65例(肿瘤组)与正常脑组织13例(对照组)，采用免疫组化、RT-PCR法，检测ADAM17蛋白及mRNA的表达；利用siRNA干扰敲减或ADAM17激活剂(PMA)过表达ADAM17，并予以PI3K抑制剂抑制相关信号通路，MTT及Transwell实验检测各组U87MG细胞的增殖与侵袭变化，Western blot检测ADAM17、p-AKT 及AKT蛋白变化。结果 胶质瘤组织中ADAM17 mRNA及蛋白水平均高于正常脑组织；与对照组相比，siRNA干扰后，低表达组U87MG细胞的增殖与侵袭能力下降，而激活剂PMA增强ADAM17后，过表达组细胞增殖与侵袭能力增加，差异有统计学意义(P<0.05)；敲减及过表达ADAM17可导致PI3K/AKT信号通路下游蛋白发生变化。结果 ADAM17可通过激活PI3K/AKT信号通路促进U87MG细胞增殖与侵袭，有望为胶质瘤的治疗找到新突破点。

ADAM17；U87MG；胶质瘤；增殖；侵袭

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:883～887)

恶性胶质瘤是中枢神经系统最为常见的原发性肿瘤之一，其发病率高、治疗困难；其中，尤以胶质母细胞瘤预后最差，其具有血供丰富、侵袭性强、死亡率高等特点[1]。因此，探究胶质瘤发生及发展的分子机制、找寻新的诊治策略已成为近年来胶质瘤的研究热点。本研究以胶质瘤及正常脑组织标本、胶质瘤细胞系U87MG为研究对象，探讨ADAM17在U87MG细胞增殖与侵袭中的作用及其机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2014年1月至2016年1月期间我院神经外科住院手术治疗的胶质瘤患者65例(肿瘤组)，纳入标准：全部患者均符合WHO胶质瘤的组织病理学诊断标准，自愿参加本研究试验并签署知情同意书。排除标准：术前放疗、化疗，合并肝肾功能障碍、心肺功能不全的患者。年龄18～73岁，平均年龄(47.36±5.69)岁，其中，WHO Ⅱ级17例，WHO Ⅲ级23例，WHO Ⅳ级25例，同期收集脑外伤内减压术后的相对正常脑组织13例(对照组)。

1.2 ADAM17蛋白及mRNA表达的检测

1.2.1 免疫组化 组织采用10%甲醛固定，石蜡包埋，冻存，置于60 ℃烤箱中烤1 h，切片脱蜡水化后HE与SP 法染色；浸泡、水浴、冲洗后滴加封闭液，37 ℃孵育15 min，滴加鼠ADAM17一抗(美国Abcam公司，ab57484)于4 ℃冰箱中过夜，PBS浸泡冲洗后滴加标记二抗，孵育、浸泡后，滴加DAB溶液，滴加双蒸水终止反应，脱水透明封片。分别用已知ADAM17阳性表达组织作为阳性对照，PBS替代一抗作为阴性对照。参照相关文献，结果判定如下[2]：ADAM17阳性表达位于细胞质与细胞膜，随机选择5个视野，根据着色强度和阳性细胞百分比来评估免疫组化结果，着黄褐色为阳性结果，染色结果总得分为染色强度评分+阳性细胞率评分；染色强度评分如下：0分(未染色)；1分(弱染色)；2分(中度染色)；3分(强染色)；阳性细胞率评分如下：无阳性细胞为0分，阳性细胞率<25%为1分，25%～50%为2分，>50%为3分。染色总得分0～2分为结果阴性，3～6分为结果阳性。

1.2.2 RT-PCR实验 采用GeneJET TM RNA纯化试剂盒(美国Thermo公司)说明提取纯化RNA，采用Trizol法提取组织总RNA，参照RNA simple Total RNA Kit 逆转录试剂盒(美国Thermo公司)逆转录合成cDNA，反应体系20 μl，置于-20 ℃冻存，解冻后行RT-PCR检测，严格参照PCR试剂盒说明书操作，采用25 μl反应体系，cDNA模板2 μl，引物设计采用Primer 5软件进行，ADAM17 cDNA序列委托由上海生工生物公司合成，同时合成GAPDH序列。ADAM17引物序列为：5'-ACGTTGAAGGAAGGTGTCCA-3'(上游引物)，5'-ACGCCTTTGCAAGTAGCATT-3'(下游引物)；GAPDH内参引物序列为：5'- CAGGAGGCATTGCTGATGAT -3'(上游引物)，5'- GAAGGCTGGGGCTCATTT -3'(下游引物)。

1.3 MTT、Transwell实验检测及Western blot检测

1.3.1 实验分组 ①ADAM17敲减分组：阴性对照组(非沉默ADAM17的阴性对照scrambled RNA序列转染U87MG细胞)与低表达组(ADAM17-siRNA转染U87MG细胞，敲减ADAM17)；②过表达ADAM17分组如下：阴性对照组(U87MG细胞未做干预)、过表达组(ADAM17激活剂-PMA处理U87MG细胞，过表达ADAM17)及PI3K抑制组(同时予以PMA和PI3K抑制剂-LY294002处理U87MG细胞)。

1.3.2 ADAM17-siRNA序列的选择及设计 在基因库中获取了人ADAM17的全长mRNA序列，运用在线软件设计了3条ADAM17-siRNA序列及1条非沉默ADAM17的阴性对照scrambled RNA序列，然后交由上海吉玛生物公司合成。ADAM17-siRNA序列：5'-GAGCCACTTTGGAGATTTGTT-3'，5'-TGGGAACTCTTGGATTAGCTT-3'，5'-TGGCATCATGTATCTGAACAA-3'；scrambled RNA序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。

1.3.3 细胞系培养及处理 人胶质瘤细胞系U87MG购于美国 ATCC公司，采用含10%小牛血清DMEM培养基培养，置于5%CO2、95% O2、37 ℃、相对湿度95%空气孵育箱中培养。根据细胞密度1∶3传代，U87MG细胞呈贴壁生长，形成致密单层细胞，利用胰酶消化。用RNase-free去离子水溶解siRNA，溶于250 μl opti-MEM中，混匀、静置，再按试剂盒说明书将5 μl LipofectamineTM2000溶于250 μl 含有ADAM17-siRNA的opti-MEM混合溶液中，静置20 min后滴加至6孔板孔中，混匀，37 ℃、5%CO2培养箱中培养；U87MG细胞以5×105个/孔的浓度接种至6孔板中，当对数生长期细胞达到85%～90%覆盖时，换无血清培养12 h，再逐步按不同实验分组分别加入ADAM17特异性激活剂(PMA)、PI3K特异性抑制剂(LY294002)继续培养72 h；上述各实验组细胞分别于24、48及72 h进行细胞计数。

1.3.4 MTT增殖实验 上述各实验组细胞提前一天消化成单细胞悬液，计数，浓度1×105个/ml，置于96孔板，每孔100 μl(即每孔细胞为1×104个)，共18孔；处理后加入MTT试剂，比例为1∶10(100 μl培养液加入10 μl检测液)，37 ℃孵育4 h后，酶联仪检测490 nm各孔的吸光度值。

1.3.5 Transwell侵袭实验 细胞转染后置于培养箱中培养24 h，消化重悬，调整细胞浓度至1×106/ml，取100 μl加入至Transwell小室上室，取600 μl完全培养基加入下室，置于培养箱中培养48 h后取出小室，显微镜下观察细胞，拍照并统计穿过的细胞数，参照Transwell试剂盒(美国Corning公司)说明书操作。

1.3.6 Western Blot 收集细胞蛋白，采用10%聚丙烯酰胺凝胶检测目的蛋白，经过SDS-PAGE电泳后(电压120 V，时间2 h)；将蛋白印迹至PVDF膜上，予5%脱脂牛奶封闭2 h，将相应的一抗：anti-ADAM17，Anti-AKT，Anti-p-AKT，4 ℃孵育，过夜后，用TBST洗2次，再予稀释二抗(HRP标记二抗，1∶4 000，Forevergen)室温下孵育1 h， 进行化学发光显影(ECL，Forevergen)，用Image J软件进行目标条带的吸光度分析。以GAPDH作为内参，检测ADAM17、p-AKT(磷酸化AKT)、AKT蛋白表达。

1.4 统计学分析

应用软件SPSS 19.0进行数据分析，计量资料采用t检验，以均数±标准差表示，计数资料采用χ2检验，P<0.05提示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤组织与正常脑组织中ADAM17蛋白阳性表达率比较

免疫组化结果提示，肿瘤组ADAM17阳性表达率为56.92%(37/65)，对照组ADAM17阳性表达率为15.38%(2/13)，肿瘤组ADAM17阳性表达率高于对照组，差异具统计学意义(χ2=7.477，P=0.006)。

2.2 胶质瘤组织与正常脑组织中ADAM17mRNA的表达差异

RT-PCR结果显示，与对照组比较，肿瘤组ADAM17mRNA含量较高，差异有统计学意义(t=6.32，P<0.05)，见图1。

图1 RT-PCR检测ADAM17mRNA的相对表达量

2.3 敲减ADAM17对U87MG细胞增殖与侵袭能力的影响

MTT结果显示，siRNA转染U87MG细胞后，随转染时间的延长，细胞的相对增殖速率明显下降，与阴性对照组相比，低表达组U87MG细胞的相对增殖速率下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2A；Transwell实验结果显示，与阴性对照组相比，低表达组U87MG细胞的侵袭能力下降(P<0.05)，见图2B。实验结果提示敲减ADAM17后U87MG细胞的增殖及侵袭能力均下降。

2.4 过表达ADAM17对U87MG细胞增殖与侵袭能力的影响

MTT结果显示，与阴性对照组比较，U87MG细胞加入PMA过表达ADAM17后，细胞的相对增殖速率明显提高；而PI3K抑制组中U87MG胶质瘤细胞的相对增殖速率较ADAM17过表达组下降，差异具有统计学意义(P均<0.05)，见图3A；Transwell实验结果显示，与阴性对照组相比，ADAM17过表达组U87MG细胞的侵袭能力增强；而与ADAM17过表达组相比较，PI3K抑制组U87MG细胞的侵袭能力减弱，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3B。实验结果提示：过表达ADAM17可促进U87MG细胞的增殖及侵袭能力提高，而过表达ADAM17的U87MG细胞中加入PI3K特异性抑制后，增强的细胞增殖及侵袭能力被逆转。

2.5 各组细胞中ADAM17、p-AKT及AKT蛋白的比较

Western Blot结果表明，敲减及过表达ADAM17均不影响细胞中AKT的总蛋白水平；siRNA干扰敲减ADAM17后，p-AKT的蛋白水平下降，表明ADAM17-siRNA可抑制AKT蛋白的磷酸化；同时，与阴性对照组相比，过表达组p-AKT的蛋白水平升高，表明过表达ADAM17能提高AKT蛋白的磷酸化水平；此外，与过表达组相比较，PI3K抑制组LY294002抑制PI3K后，磷酸化AKT蛋白水平下降，见图4；结果提示：ADAM17调控U87MG细胞的增殖和侵袭，可能是通过激活PI3K/AKT信号通路实现的。

3 讨论

目前，恶性胶质瘤的治疗主要采取手术为主、放化疗为辅的方式进行，但其疗效较差，平均生存期短[3]。因此，探寻胶质瘤发生机制及其新治疗手段已成为近期胶质瘤研究的热门。随着分子生物学与表观遗传学的研究进展，分子生物学相关因子在胶质瘤的发生与发展中的决定性作用逐渐被认识。研究表明，胶质瘤的发生、发展与致癌基因的高表达、抑癌基因的失活及信号通路失调紧密相关[4]。因此，相关致癌基因及其病理机制的研究在胶质瘤的诊治中具有重要的意义。ADAM17，是基质金属蛋白酶(MMPs)的1种，作为ADAMs 家族一员，具有阻止抑癌基因转录、调控细胞周期等促癌基因的作用[5]。既往报道指出，ADAM17在胃癌及乳腺癌等肿瘤组织中异常高表达[6-7]；但其在胶质瘤中的含量表达及其在胶质瘤细胞增殖和侵袭中作用机制的相关研究较少。研究表明，ADAM17可降解细胞外基质的胶原及明胶等成分，增加细胞间质空隙，促进肿瘤血管的形成，利于其侵袭及转移[8-9]。同时，ADAM17亦能剪切脱落和活化的多种表皮生长因子受体的配体，激活EGFR的相关通道，从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[10-11]；而EGFR下游的PI3K/AKT信号通路在胶质瘤细胞恶性生物学行为中发挥了重要作用[12]。因此，本研究中，我们大胆推测ADAM17可能同样通过激活PI3K/AKT通路来促进U87MG细胞的增殖和侵袭。

A为各组U87MG细胞的增殖能力比较；B为各组U87MG细胞侵袭能力比较。

A为各组U87MG细胞的增殖能力比较；B为各组U87MG细胞侵袭能力比较。

A为敲减ADAM17前后各组U87MG细胞的ADAM17、AKT、p-AKT蛋白水平对比；B为过表达ADAM17前后各组U87MG细胞的ADAM17、AKT、p-AKT蛋白水平对比。

基于上述推测，我们开展了本研究，旨在探讨PI3K/AKT信号通路在ADAM17调控U87MG细胞增殖、侵袭中的作用及机制。本研究结果显示，ADAM17在胶质瘤组织中表达水平较正常脑组织升高，预示ADAM17可能在胶质瘤的发生发展进程中具有重要意义。同时，siRNA干扰敲减ADAM17后的U87MG细胞增殖与侵袭能力明显降低，PMA处理细胞过表达ADAM17后U87MG细胞的增殖速率与侵袭能力明显增高。为了弄清ADAM17调控U87MG细胞增殖、侵袭过程的作用机制，我们研究了AKT蛋白及其磷酸化，结果显示，与对照组比较，低表达组U87MG细胞通过转染siRNA敲减ADAM17后，ADAM17蛋白表达明显下降，具有活性作用的磷酸化AKT表达亦随之明显降低，胶质瘤细胞的侵袭、增殖减弱；而与对照组比较，在ADAM17过表达组和PI3K抑制组U87MG细胞中，APM可诱导ADAM17的表达增加，同时p-AKT表达亦随之升高，细胞的增殖速率和侵袭能力均明显增强；但在PI3K抑制组细胞中先加入PMA，再加入PI3K抑制剂LY294002处理后，与只加入PMA处理的过表达组相比，测得的p-AKT蛋白表达明显降低，增强的U87MG细胞的增殖与侵袭能力被部分逆转。上述结果表明ADAM17的异常表达对胶质瘤细胞增殖和侵袭有明显影响，其促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭等恶性生物学进程可能是活化了PI3K/AKT信号通路导致的。深入分析原因可能为：ADAM17具有水解肿瘤坏死因子(TNF-α)的功能，其蛋白剪切酶样作用，造成TNF-α、EGFR的配体剪切活化，激活EGFR与下游PI3K/AKT信号通路，促进肿瘤细胞的生长、转移及侵袭[5，11]。

综上所述，ADAM17在调控胶质瘤细胞增殖和侵袭等恶性生物学行为过展中发挥了重要的作用，其可能是通过激活EGFR/PI3K/AKT信号通路影响胶质瘤细胞增殖及侵袭过程，从而促进胶质瘤的发生与发展，故有望将ADAM17作为抗胶质瘤治疗的新靶点。

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(编辑：吴小红)

Role and Mechanism of ADAM17-mediated Proliferation and Invasion of U87MG Glioma Cell

LIShun,TANGXiaoping,FENGLing,etal.

AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,637000

Objective To investigate role and mechanism of ADAM17-mediated proliferation and invasion of U87MG glioma cell.Methods The expression levels of ADAM17 in 65 cases of gliomas and 13 cases of normal brain tissues were detected by immunohistochemical staining and RT-PCR.The proliferation and invasion ability of U87MG cells were detected by MTT and transwell assays after silencing ADAM17 by siRNA or overexpression ADAM17 with the ADAM17 agonist(PMA).Western Blot was used to detect ADAM17,AKT and p-AKT protein expression of U87MG cells in each group.Results ADAM17 mRNA and protein expressions were both higher in glioma than that in normal brain tissues (P<0.05);Compared with the control group,stimulation of U87MG cells with the ADAM17 agonist(PMA) improved the proliferation and invasion ability,while knock-down of ADAM17 in U87MG cells by si-ADAM17 decreased the proliferation and invasion ability (P<0.05).Knock-down or overexpression ADAM17 can lead to p-AKT protein changes of PI3K/AKT signaling pathway.Conclusion ADAM17 could mediate the proliferation and invasive of U87MG glioma cell by activating PI3K/AKT signaling pathway.It is expected to find a potential therapeutic target for the treatment of glioma.

ADAM17;U87MG;Glioma;Proliferation;Invasion

南充市科学技术和知识产权局项目(编号:14A0040)

637000 川北医学院附属医院

唐晓平

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.06.004

R730.264

A

1001-5930(2017)06-0883-05

2016-07-12

2017-03-09)