葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1在应激刺激下与T细胞胞内抗原1共同参与应激颗粒聚集

邵洁，张兵兵，赵猛，周云丽，任丽

葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1在应激刺激下与T细胞胞内抗原1共同参与应激颗粒聚集

邵洁，张兵兵，赵猛，周云丽，任丽△

目的探讨葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1（SND1）在应激刺激下如何与T细胞胞内抗原1（TIA-1）共同参与应激颗粒（SG）的聚集以及如何调节应激反应。方法利用免疫荧光实验和激光共聚焦显微镜观察HeLa细胞中的SND1蛋白与TIA-1蛋白在应激刺激下是否形成共定位颗粒，并利用绿色荧光蛋白载体过表达质粒转染HeLa细胞进行外源蛋白表达，从而确定在应激刺激下SND1蛋白与TIA-1结合的结构域。利用RNA干扰技术敲除HeLa细胞中SND1蛋白表达并利用Western Blotting检测蛋白表达水平，从而观察SND1低表达是否对TIA-1聚集形成SG产生影响。利用不同热休克刺激时间观察SND1与TIA-1的聚集过程是否存在动态变化。结果SND1蛋白在应激刺激下与TIA-1蛋白结合共同参与SG聚集，其主要作用结构域为葡萄球菌核酸酶结构域（SN domain）。SND1低表达不会抑制TIA-1聚集到SG，但会减少SG的数量。在不同热休克刺激时间下，SND1聚集到SG的运输过程滞后于TIA-1。结论SND1蛋白在应激刺激下与TIA-1蛋白共同参与SG的聚集，从而调节细胞应激反应。

应激；RNA干扰；葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1；T细胞胞内抗原1；应激颗粒

真核细胞在受到应激刺激时会启动细胞的保护机制，聚集可调节细胞功能的蛋白形成应激颗粒（SG）。SG的成分包括未被翻译的mRNA、翻译起始因子、核糖体、RNA结合蛋白等［1］。SG的主要功能

被认为是抑制mRNA的翻译，同时选择性地合成生存急需蛋白，从而保护细胞免受应激侵害［2］。本课题组前期研究发现葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1（SND1）可与Ras-GAP SH3结构域结合蛋白（G3BP）结合从而参与SG形成，并调节细胞应激反应［3］。另有研究表明SND1作为含有多聚A尾mRNA的结合蛋白参与mRNAs的代谢与穿梭［4］，而SND1在参与应激反应时其103位的苏氨酸会被磷酸化修饰［5］，但其对抗应激刺激的具体机制尚未阐明。T细胞胞内抗原1（TIA-1）是参与SG聚集、结合多聚A尾mRNA的RNA结合蛋白［6-7］。TIA-1是RNA识别模序类家族成员，在稳定状态下会富集于细胞核内，同时也会在某些生理状态下穿梭于胞核与胞质之间［7］，并且TIA-1是SG的标志蛋白，其朊病毒样结构域（PRD）具有自我聚集功能，可促进SG中的RNA结合蛋白聚集［6］。本研究旨在探讨SND1蛋白如何通过与TIA-1结合参与应激反应，从而为今后研究细胞应激反应等保护机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系与过表达质粒 HeLa细胞由芬兰坦佩雷大学医学技术研究所分子免疫学实验室惠赠。绿色荧光蛋白载体过表达质粒包括pEGFP-SND1全长蛋白、pEGFP-SN片段、pEGFP-TSN片段，均为天津医科大学基础医学院免疫学教研室构建。

1.1.2 主要试剂及仪器 抗SND1抗体（鼠源，多克隆抗体）、抗α-Tubulin抗体（兔源，多克隆抗体）、Texas Red-596标记的抗羊荧光二抗（兔源，多克隆抗体）、Alexa Flour-488标记的抗鼠荧光二抗（兔源，多克隆抗体）购自Abcam公司。抗SND1抗体（羊源，多克隆抗体）、抗TIA-1抗体（羊源，多克隆抗体）购自Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记的抗鼠源、抗羊源、抗兔源的IgG二抗购自晶美公司。Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。亚砷酸钠（Arsenite Sodium）购自美国Sigma公司。小干扰RNA序列，包括乱序siRNA（Scramble siRNA）和siRNA-SND1由美国Invitrogen公司设计并合成。激光共聚焦显微镜（FV1000，日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 应激刺激实验 培养HeLa细胞，在细胞处于对数生长期时将HeLa细胞分别接种到3个90 mm培养皿中，分为A、B、C组，A组即正常对照组，37℃培养；B组以45℃-45 min刺激；C组为亚砷酸钠0.5 mmol/L-1 h刺激，即培养基中加入亚砷酸钠至终浓度为0.5 mmol/L。按以上刺激条件对细胞进行应激刺激，由于TIA-1是SG的标志蛋白，所以SG形成标准为：HeLa细胞经过抗TIA-1抗体染色后，在显微镜下能观察到TIA-1呈阳性表达的红色荧光颗粒即为SG。

1.2.2 免疫荧光和激光共聚焦实验 对经过以上刺激条件

的HeLa细胞进行免疫荧光抗体染色。首先用4%多聚甲醛-PBS溶液对细胞进行固定，再加0.2%TritonX-100-PBS溶液对细胞透化处理，并用0.2%BSA-PBS溶液封闭细胞之后进行抗体孵育：加一抗anti-TIA-1羊源（1∶200）在水平摇床上4℃摇16 h，之后加德克萨斯红（Texas Red）抗羊二抗荧光抗体（1∶500）在水平摇床上室温摇1 h。再加一抗anti-SND1鼠源（1∶50）和阿莱克斯荧光（Alexa Flour）488抗鼠二抗荧光抗体（1∶500），方法同前。最后用DAPI溶液进行核染色，标本用激光共聚焦显微镜观察并收集图片，100×放大物镜。结果图片用Image J 1.48u图像处理软件编辑和整理。红色图片是细胞中的TIA-1的表达与定位，绿色图片是SND1的表达与定位，处理后可观察两蛋白细胞内共定位（即绿色与红色重叠的黄色图片）。

1.2.3 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）实验 培养HeLa细胞，设置A、B、C 3组，3组细胞的处理条件同方法1.2.1，进行应激刺激后裂解HeLa细胞，每个培养皿加细胞裂解液，冰上作用30 min，之后采用超声破碎法裂解细胞，离心，收集上清获全细胞裂解液；BCA法测定总蛋白浓度，并取出3组各自的全细胞裂解液样本的10%作为Input（阳性对照）。再将每组全细胞裂解液混匀后按体积均分3份，每份样本分别加入抗 SND1抗体（1∶500）、抗 TIA-1抗体（1∶200）和IgG抗体（作为阴性对照）以及琼脂糖4B磁珠，在4℃水平摇床作用16 h后离心，收集磁珠后得到蛋白复合物样本，进行蛋白免疫印迹实验。

1.2.4 蛋白免疫印迹实验（Western Blotting） 将Co-IP方法得到的蛋白复合物在4%SDS-PAGE浓缩凝胶和10%SDSPAGE分离凝胶进行凝胶分离蛋白。电泳结束后将凝胶在250 mA、90 min条件下电转到PVDF膜上，牛奶常温封闭1 h，TBST冲洗，裁剪目的条带SND1和TIA-1，分别置于抗SND1抗体（1∶2 000）和抗 TIA-1抗体（1∶1 000）以及抗 α-Tubulin（1∶5 000）抗体中4℃孵育过夜。而后将PVDF膜置于二抗（1∶5 000）孵育液中1 h，最后用ECL发光底物显色阳性蛋白条带。

1.2.5 pEGFP过表达质粒和小干扰RNA转染实验 培养HeLa细胞，对数生长期时将细胞接种于6 cm培养皿中，饥饿过夜。取3份同样的10 μL Lipofectamine 2000分别加入3份200 μL无血清培养基中孵育10 min。再将过表达质粒pEGFP-SND1全长蛋白、pEGFP-SN和pEGFP-TSN片段各取10 μL，分别加入3份200 μL无血清培养基中孵育10 min。之后将1份Lipofectamine 2000混合物与pEGFP-SND1全长蛋白质粒混合物再孵育20 min，另2个质粒混合物依此同法。最后将3种质粒混合物缓慢滴加于3组细胞中，边滴加边混匀，培养24～48 h后观察转染效率。小干扰RNA转染的方法同质粒转染。Scramble siRNA序列为5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3′（作为阴性对照，不敲除SND1的表达），SND1-siRNA 序列为 5′-AAGGCATGAGAGCTAATAATC-3′，并利用Western Blotting检测SND1是否被敲除。

2 结果

2.1 SND1与TIA-1在应激刺激下可以形成细胞内共定位颗粒 激光共聚焦显微镜下可见，SND1在应激刺激下与TIA-1可形成细胞内共定位颗粒。A组显示SND1与TIA-1弥散、均匀地分布于细胞内，无共定位颗粒出现。B组和C组可见SND1与TIA-1聚集于同一颗粒中，这些颗粒即为SG，见图1。

Fig.1 SND1 co-localized with TIA-1 on stress granules under stress condition(scale bar 10 μm)图1 SND1在应激刺激下与TIA-1形成共定位颗粒（比例尺 10 μm）

Fig.2 SND1 interacted with TIA-1 weakly under stress stimuli图2 SND1在应激刺激下与TIA-1有微弱的蛋白结合作用

Fig.3 SN domain of SND1 associated with TIA-1 under stress stimuli(scale bar 10 μm)图3 SN结构域是SND1在应激刺激下与TIA-1相互作用结构域（比例尺10 μm）

2.2 SND1蛋白与TIA-1在应激刺激下可形成微弱的Co-IP结合 Co-IP结果显示，A组培养条件下得到的蛋白复合物中几乎检测不到SND1和TIA-1的结合作用。而在B组和C组培养条件刺激下，Co-IP所得到的蛋白复合物中能检测到两者微弱的结合作用，见图2。

2.3 SND1在应激刺激下通过其SN结构域与TIA-1产生细胞内共定位 不同蛋白片段与TIA-1的蛋白定位情况有所不同，pEGFP-SND1、pEGFP-SN过表达蛋白均可与TIA-1形成共定位颗粒，但pEGFP-TSN过表达蛋白不能与TIA-1形成共定位颗粒，见图3。

2.4 敲除HeLa细胞内源性SND1蛋白的表达 转染了SND1-siRNA的HeLa细胞被敲除了SND1表达。转染了SND1-siRNA的HeLa细胞，SND1表达降低，而转染了Scramble siRNA的HeLa细胞并没有影响SND1表达量，同时以TIA-1以及α-tubulin的表达作为参照蛋白，见图4。

2.5 敲除SND1表达未抑制TIA-1的聚集但会影响SG的大小和数量 敲除HeLa细胞的SND1蛋白表达后，免疫荧光结果显示SND1低表达，未影响TIA-1的聚集，但减少了SG的数量。转染了ScramblesiRNA的HeLa细胞在应激刺激下，SND1与TIA-1的聚集未受任何影响，而转染了SND1-siRNA的HeLa细胞经过45℃-45 min刺激后，虽然TIA-1仍能聚集形成SG，但SG的数量明显减少，见图5。

2.6 SND1在应激刺激下聚集到SG的过程滞后于TIA-1 在不同的热休克刺激时间下，随着刺激时间的延长，SND1与TIA-1逐渐聚集形成SG，在刺激5 min时已经可见明显的TIA-1阳性颗粒，但SND1的聚集还不明显，刺激30 min时SND1阳性颗粒才基本形成，两者共同聚集于SG。在不同的刺激时间，分别计数100个HeLa细胞，其中含有SND1阳性颗粒的细胞数明显少于含有TIA-1阳性颗粒的细胞数，SND1聚集到SG的运输过程滞后于TIA-1，见图 6、7。

Fig.4 The expression of SND1 interfered by RNAi and measured by Western Blotting assay图4 SND1蛋白表达水平通过RNAi被敲除并利用Western Blotting检测蛋白表达

Fig.5 Knockdown of SND1 did not inhibit the recruitment of TIA-1 onstress granules(scale bar 10 μm)图5 敲除SND1不会抑制TIA-1聚集到SG（比例尺10 μm）

Fig.6 Aggregation of SND1 laged behind TIA-1 on stress granules(scale bar 10 μm)图6 SND1聚集到SG的过程滞后于TIA-1（比例尺10 μm）

3 讨论

SG是细胞在应对应激刺激时形成的胞内动态颗粒结构［3］。当真核细胞受到氧化应激、热休克、紫外线照射及病毒感染等应激刺激时，首先会终止蛋白质翻译的起始过程，然后重新改编mRNAs代谢程序，调节具有修复损伤功能的蛋白质基因转录及表达［3，8-9］。由此，细胞胞质中就形成了这种无胞膜的细胞亚结构［4］，它的出现是细胞保护性机制启动的表现。近来研究报道了TIA-1、G3BP、多聚A尾mRNA结合蛋白（PABP）等许多分子都参与SG的聚集［7，10］。TIA-1 作为 SG 的重要标志蛋白，可以通过其PRD结构调节SG中蛋白的相互聚集过程，因而被称为 SG 的启动因子［2，11］。TIA-1 可调节血管紧张素Ⅱ受体 1（AT1R）的 mRNA 的聚集［12］，这些研究显示TIA-1是调节SG功能的重要分子。

SND1是近来发现参与SG聚集的组分之一，其不仅可以与G3BP结合参与SG的形成［3］，还可与AT1R共定位于SG，调节其聚集和穿梭过程，并可调节多聚A尾mRNAs向SG的聚集过程［4，13］。而本研究显示SND1在应激刺激时通过其SN结构域与TIA-1结合并共定位于SG，证实SND1实现其功能的结构基础是N端4个相似的葡萄球菌核酸酶样结构域［3，14］。由此结果推测SN结构域很可能起到蛋白与蛋白之间的桥联作用，从而促进蛋白复合物的形成。另外，RNAi敲除SND1表达不会影响TIA-1聚集形成SG，提示SND1不是启动SG聚集的蛋白组分，SG的形成也不是单一某个蛋白就能决定的。其具体机制，一方面可能与蛋白自身结构特点有关，另一方面可能与其调节不同的RNA代谢有关，SND1的缺失可能只影响某一类mRNA的代谢而不会影响其他mRNA及RNA结合蛋白的聚集，由此就表现为聚集颗粒数量的减少而不是完全被抑制。而在不同热休克刺激时间下，TIA-1是先于SND1聚集到SG的蛋白，这也佐证了SG中的蛋白聚集是有时序性和阶段性的，应激刺激所影响的mRNA及对应的RNA结合蛋白很可能在某些具有引导作用的分子的“指挥”下或依赖不同的信号通路按照一定的时间顺序聚集成SG，由此可以推测SG结构具有动态可变性，这可能与不同的刺激因素和刺激时间有关［8］。

综上所述，SND1在应激刺激下与TIA-1共同参与SG聚集，从而参与细胞的应激反应。SG从本质上说就是被终止翻译的那些“受伤”的mRNAs的分类急救中心［9，15］，它不仅掌管着那些 mRNAs的最终命运，而且也作为细胞的信号通路上的“集线器”直接参与应激状态下的不同信号通路之间的“沟通与对话”［9,16］。而 SND1作为具有结合多聚A尾mRNAs的一种RNA结合蛋白，其参与真核细胞对抗应激刺激的生物学机制势必成为SG及应激相关理论的关键点之一［17］。尽管SND1究竟参与哪种mRNA的代谢以及遵循哪几条信号通路起作用仍有待进一步验证，但其作为SG的重要组分已经逐渐成为SG理论研究和治疗相关疾病的潜在新靶点。

Fig.7 The number of cells per 100 with SND1+and TIA-1+granules under different stress time points图7 在不同刺激时间下每100个HeLa细胞中的含有SND1+颗粒和TIA-1+颗粒的细胞数

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（2017-03-06收稿 2017-04-27修回）

（本文编辑 李国琪）

SND1 protein co-localization with TIA-1 on stress granules under stress stimuli

SHAO Jie,ZHANG Bing-bing,ZHAO Meng,ZHOU Yun-li,REN Li△
Department of Clinical Laboratory,Cancer Institute and Hospital,Tianjin Medical University,National Clinical Research Center of Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China△

E-mail:roland-li@163.com

ObjectiveTo analyze the association of staphylococcal nuclease domain-containing protein 1(SND1)and T-cell intracellular antigen 1(TIA-1)on stress granules,and the regulation of SND1 on stress granules under stress stimuli.MethodsThe immunofluorescence assay and laser scanning confocal microscopy were used to observe the co-localization of SND1 protein and TIA-1 protein under stress stimuli,and the over-expression plasmids of pEGFP vector were transfected into HeLa cells and to verify which domain of SND1 co-localized with TIA-1 under stress stimuli.RNA interferencemediated knockdown of the expression of SND1 protein in HeLa cells was measured by Western Blotting assay.Then whether the knockdown of SND1 affected the recruitment of TIA-1 on stress granules was observed.Heat shocks under different times were used to identify whether there were dynamic changes in transportation of SND1 and TIA-1 on stress granules.ResultsSND1 co-localized with TIA-1 on stress granules under stress stimuli,and the associated domain of SND1 were SN domain.TIA-1 still can be recruited on stress granules but a large amount of stress granules were reduced even though the expression of SND1 protein was decreased.And the transportation of SND1 on stress granules was laged behind TIA-1 under different-times of heat shocks.ConclusionSND1 protein co-localizes with TIA-1 on stress granules,and which co-regulates the cellular stress response under stress stimuli.

stress;RNA interference;Staphylococcal nuclease domain-containing protein 1;T-cell intracellular antigen 1;stress granule

R349.5

：A

10.11958/20170286

国家自然科学基金青年项目（31501091）

天津医科大学肿瘤医院检验科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室（邮编300060）

邵洁（1980），女，博士研究生，讲师，主要从事免疫学及临床肿瘤标志物研究

△通讯作者 E-mail:roland-li@163.com