miR-630在肺腺癌组织中的表达及其对肺腺癌细胞迁移侵袭的影响

谢铭芳 唐蒙蒙 丁伟

●基础研究

miR-630在肺腺癌组织中的表达及其对肺腺癌细胞迁移侵袭的影响

谢铭芳 唐蒙蒙 丁伟

目的 研究miR-630在人肺癌组织中的表达，探讨miR-630对肺腺癌细胞系（A549）细胞迁移侵袭的影响及其机制。方法 收集37例肺腺癌组织标本及癌旁正常肺组织，通过RT-PCR检测各标本中miR-630、SOX4 mRNA的表达情况，Pearson相关分析检验miR-630与SOX4的相关性；通过转染miR-630mimic和miR-630NC至离体培养的A549细胞中，Western blot检测A549细胞中COL1A1、COL1A5、SOX4的表达情况，划痕试验和Transwell法观察细胞迁移侵袭情况，荧光素酶素试验验证SOX4是miR-630的靶基因。结果 与癌旁正常肺组织比较，miR-630在肺腺癌组织中的表达降低（P＜0.05）；肺腺癌组织中SOX4 mRNA的表达增加（P＜0.01）；miR-630与SOX4 mRNA的表达量呈负相关（r=-0.344，P＜0.01）。与对照组比较，转染miR-630mimic后A549细胞的迁移侵袭减少（P＜0.01），细胞中COL1A1、COL1A5、SOX4的表达减少（均P＜0.05）；荧光素酶试验结果显示，miR-630能够降低SOX4-3′-UTR质粒的荧光素活性（P＜0.05）。结论 miR-630在肺腺癌组织中低表达；miR-630可能是通过下调SOX4抑制A549细胞的迁移和侵袭。

肺腺癌 微小RNA-630 SOX4 侵袭

microRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码小RNA，可调控多种肿瘤细胞的迁移和侵袭[1]。在肺癌细胞研究中，目前热门的miRNAs包括miR-630、miR-32、miR-21、miR-34、miR-138、miR-206，但是目前人肺癌组织中这些miRNAs的表达情况鲜有研究报道。SOX4基因（SRY related high-mobile group box4）属于SOX基因家族中C亚族，其编码的蛋白通过HMG盒（high－mobility group DNAbinding domain）与DNA结合，调控靶基因的转录活化或抑制。已经有大量的研究发现SOX4参与多种肿瘤的发生和发展，具有抑癌基因和癌基因双向调节功能[2]。抑制SOX4的表达可以抑制肺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞、宫颈癌细胞等多种肿瘤细胞的迁移和侵袭[3－6]。笔者在预实验中通过实时荧光定量PCR检测15例患者肺腺癌组织、正常肺组织中miR－630、miR－32、miR－21、miR－34、miR－138、miR－206的表达情况，发现miR－630和miR－32在肺腺癌组织中表达减少。本研究拟通过扩大样本量，验证miR－630在肺癌组织中的表达情况，及其与SOX4表达量之间的相关性关系，并通过细胞实验进一步探索miR－630对肺腺癌细胞迁移侵袭的影响以及SOX4的作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2015年4至9月37例肺腺癌患者手术切取的肺腺癌组织及癌旁正常肺组织（绍兴市柯桥区中医医院4例，浙江大学医学院附属第一医院胸外科33例），男16例，女21例，年龄41～74（63.7±6.9）岁；所有患者术前均未行任何放、化疗。肺腺癌诊断经病理诊断确认，TNM分期Ⅰ期患者2例，Ⅱ期患者19例，Ⅲ期患者12例，Ⅳ期患者4例。

1.2 方法

1.2.1 试剂 肺腺癌细胞株A549购于上海拜力生物公司；胎牛血清（美国GIBCO公司）；DMEM培养液、胰蛋白酶（美国Sigma公司）；RNA提取试剂（美国Invitrogen公司）；兔或鼠抗人COL1A1、COL1A5、SOX4、βactin多克隆抗体（美国ABCAM公司）；辣根过氧化酶标记的二抗（美国Jackson公司）；脂质体2000（中国上海英骏公司）；Western blot相关试剂（中国江苏碧云天生物技术研究所）。

1.2.2 实验分组 手术取下的组织根据病理结果分为肺腺癌组、癌旁正常肺组织组；细胞实验中，在miR－630mimic转染A549细胞后，将细胞分为对照组和miR－630 mimic组。

1.2.3 荧光定量RT－PCR检测miR－630和SOX4 mRNA的表达 提取组织或细胞中总RNA，将提取的RNA进行逆转录成cDNA，反应体系为20μl，反应条件为：37℃反转录15min，85℃反转录酶失活5s，4℃保存。运用SYBR Green法检测miR－630、SOX4 mRNA的表达情况，运用的反应条件为：94℃预变性15min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共循环40次；最后72℃延伸8 min。每组样品重复3次，试验重复3次，统计分析各标本中miR－630和SOX4 mRNA的表达。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达量 提取细胞中总蛋白，BCA法定量蛋白，SDS－PAGE胶每孔加入30μl的样品，70V 30min进行蛋白浓缩，100V 2h进行蛋白电泳，并用孔径0.45μm的PVDF膜250mA 90min进行转膜。转膜后常温下TBST洗膜3次、封闭1h后，以1∶1 000浓度加入兔（鼠）抗人COL1A1一抗（或抗COL1A5、SOX4、β－actin一抗），4℃孵育过夜，常温下TBST洗膜3次，辣根过氧化物酶标记羊抗兔（鼠）二抗（1∶5 000）孵育后ECL化学发光法检测。柯达胶片暗室显影，Quantity one软件分析。

1.2.5 转染细胞株 过表达质粒的构建：miR－630mimic由上海吉玛公司设计合成，miR－630mimic序列为：正义链：5′－AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU－3′，反义链：3′－ACCUUCCCUGGUACAGAAUACU－5′。转染：将A549细胞系接种至6孔板，生长至50%～70%密度时，以脂质体2 000转染miR－630mimic或miR－630NC，各100pmol 24h后，提取总RNA/蛋白后，PCR/Western blot鉴定转染效率，进行后续试验。

1.2.6 细胞划痕实验（Wound Healing）测定A549细胞迁移 A549细胞先用1.8mmol/L羟基脲作用12h抑制细胞增殖，100μl枪头垂直孔板制造细胞划痕，弃细胞培养液，PBS冲洗孔板3次。拍照记录0、24h后划痕图片，用image pro plus6.0软件分析计算细胞迁移面积。

1.2.7 Transwell法测定细胞侵袭 A549细胞先用血清饥饿使细胞同步化，1.8mmol/L羟基脲作用12h用抑制细胞增殖，用0.25%胰蛋白酶消化A549细胞后，用DMEM培养基（1%血清）配成细胞悬液并计数（5×104个/ml）。各组24孔板配套Transwell小室（0.8μm）上室加入200μl的细胞悬液，下室加入含有10%FBS的培养液500μl，分别培养24h。以棉签擦去上层未穿透膜的A549细胞，取下Transwell半透膜，PBS洗3次，用3.7%多聚甲醛室温固定5min，再用PBS洗3次，用1mg/ml的结晶紫染色，PBS洗3次，倒置显微镜每组随机取5个视野观察计数并记录穿膜细胞数。

1.2.8 荧光素酶试验 设计合成SOX4－3′－UTR的序列及突变序列，以SOX4质粒为载体，分别构建能够表达荧光素酶的包含SOX4－3′－UTR和SOX4－3′－UTR突变序列的质粒，然后将A549细胞系按每孔1×105接种至24孔板，24h后以脂质体2000共转染200ng包含SOX4－3′－UTR或SOX4－3′－UTR突变序列的荧光素酶质粒和 80ng海肾荧光质粒以及 60pmol miR－630－mimic或对照，48h后用荧光检测仪测荧光强度，海肾荧光作为内参照，每组试验重复3次。

1.3 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以表示，两组间比较用t检验；SOX4 mRNA表达量与miR-630表达量间相关性分采用Pearson相关分析。

2 结果

2.1 癌旁正常肺组织、肺腺癌组织中miR-630和SOX4 mRNA的表达 检测发现miR-630在肺癌组织中表达减少，SOX4 mRNA在肺癌组织中表达升高，与癌旁正常肺组织比较差异均有统计学意义（均P＜0.01）；相关性分析结果显示SOX4 mRNA的表达量与miR-630的表达量之间呈负相关（r=-0.3928，P＜0.01），见图1。

2.2 miR-630对A549细胞侵袭迁移的影响 miR-630mimic转染A549细胞后，miR-630组中A549的迁移均较对照组减少（均P＜0.01），见图2a-b（插页）。Western blot检测发现，miR-630组 A549细胞中COL1A1和COL1A5与细胞迁移密切相关的蛋白表达均较对照组减少（均P＜0.01），见图2c（插页）。

图1 癌旁正常肺组织、肺腺癌组织中miR-630和SOX4 mRNA表达情况（a：miR-630在癌旁正常肺组织、肺腺癌组织中的表达情况；b：SOX4 mRNA在肺组织、肺腺癌组织中的表达情况；c：miR-630与SOX4 mRNA的相关性；与癌旁正常肺组织比较，*P＜0.01）

2.3 miR-630通过识别3′-UTR抑制SOX4的表达Western blot检测结果显示，miR-630 mimic组A549细胞中SOX4的表达较对照组明显降低（P＜0.01），见图3。分别构建包含SOX4-3′-UTR和其突变序列的荧光素酶质粒，见图4a。与miR-630mimic或者miR-630NC共转A549细胞，培养24h后，检测各组细胞中荧光素酶活性。实验结果显示，miR-630mimic+WT-SOX4-3′-UTR组荧光素酶活性低于miR-630NC+WT-SOX4-3′-UTR组（P＜0.01），见图4b。

图3 miR-630抑制SOX4的表达（与对照组比较，*P＜0.01）

图4 miR-630通过识别3′-UTR抑制SOX4的表达（a：miR-630与SOX4-3′UTR靶向结合示意图；b：各组荧光素酶活性，与对照组比较，*P＜0.01）

3 讨论

转移和侵袭是肿瘤基本的生物学特征，不仅跟肿瘤细胞的黏附能力下降、侵袭性增强有关，还与肿瘤组织中血管生成、细胞外基质（ECM）的降解及间质重构等过程密切相关[7]。因此，抑制肺腺癌细胞侵袭和迁移对临床治疗肺腺癌有重要意义[8]。

miRNAs是一类高度保守的小分子非编码单链RNA，大量的研究已经发现miRNAs参与调控肿瘤细胞的迁移和侵袭[9]。本研究检测了癌旁正常肺组织以及肺腺癌组织中miR-630的表达，发现miR-630在肺腺癌组织中的表达减少。miR-630是一种抑癌miRNAs，参与调节多种与肿瘤侵袭转移有关蛋白的表达，可调控多种肿瘤的发生与发展[10-13]。据此结果，笔者选择进一步研究miR-630对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响。在离体实验中，笔者发现miR-630mimic抑制A549细胞的迁移和侵袭，同时还可以下调COL1A1和COL1A5这两个与肿瘤迁移侵袭密切相关的蛋白的表达。

SOX4基因属于SOX C亚族，主要在胚胎发育过程中的心脏、中枢神经系统、胸腺高表达。此外，SOX4还在一些干细胞和祖细胞中高表达，对干细胞的稳定和分化具有重要的调控作用。因此，SOX4基因突变、缺失或者过表达不仅仅会引起先天性疾病，还与肿瘤的发生、发展密切相关。已有研究结果显示，SOX4基因在多种肿瘤组织中表达升高[2]。Shen等[14]和Wang等[15]研究还发现SOX4基因的表达与多种肿瘤患者预后相关，并预测SOX4可以作为肿瘤治理的一个靶向位点。此外，近期的研究发现miR-211通过靶向抑制SOX4的表达从而抑制SGC-7901细胞的侵袭。与上述研究结果相符，本研究显示，相比于肺癌旁组织，SOX4在肺腺癌组织中表达升高，并且与miR-630的表达量呈负相关。这些结果提示在肺腺癌中，miR-630可能也可以通过下调SOX4发挥抑制细胞迁移侵袭的作用。在之后的离体实验中，本研究组进一步发现在用miR-630mimic干预A549细胞后，细胞中SOX4的表达减少。荧光素酶实验显示miR-630可以与SOX4的3′-UTR靶向结合。在预先用SOX4过表达质粒转染 A549细胞，发现过表达 SOX4可以增加COL1A1和COL1A5的表达，逆转miR-630对A549细胞迁移侵袭的抑制作用。以上结果提示miR-630是通过下调SOX4的表达，从而发挥抑制A549细胞迁移侵袭的作用。

本实验通过实时荧光定量PCR检测正常肺组织和肺腺癌组织中miR-630和SOX4 mRNA的表达情况，发现miR-630在肺腺癌组织中表达减少、SOX4在肺腺癌组织中表达增加，两者之间呈负相关。之后在离体实验中证实miR-630可以抑制A549细胞的侵袭迁移，并进一步通过荧光素酶试验证实miR-630结合SOX4-3′-UTR的序列，为肺腺癌的治疗提供新的思路。

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Expression of miR-630 in lung adenocarcinoma and its effect on tumor migration and invasion

XIE Mingfang，TANG Mengmeng, DING Wei,et al.Department of Clinical Laboratory,Shaoxing Keqiao Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shaoxing 312030, China

Lung adenocarcinoma miR-630 Sex determining region Y-box 4 Invasion

2016-12-01）

（本文编辑：严玮雯）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.12.2016-2015

浙江省自然科学基金项目（LY14H0200002）

312030 绍兴市柯桥区中医医院检验科（谢铭芳）；浙江大学医学院附属第一医院病理科（唐蒙蒙、丁伟）

丁伟，E-mail:dingweihz1977@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of miR-630 in lung adenocarcinoma and its effect on tumor invasion and metastasis. Methods The expressions of miR-630 and SOX4 mRNA were detected by RT-PCR in 37 samples of lung adenocarcinoma tissue and matched normal lung tissue.Pearson correlation analysis was performed to test the correlation of miR-630 with SOX4 mRNA.Human lung adenocarcinoma A549 cells were transfected with miR-630.The migratory ability of A549 cells was tested by wound healing and Transwell assays;the expressions of COL1A1,COL1A5 and SOX4 in A549 cells were detected by Western blotting;Luciferase assay was used to confirmed whether SOX4-3'-UTR was the target gene of miR-630. Results Compared with normal lung tissue,the expression of miR-630 was decreased and SOX4 mRNA was significantly increased in lung adenocarcinoma (P＜0.05,P＜0.01).Pearson correlation analysis showed that miR-630 was negatively correlated with SOX4 mRNA (r=-0.344,P＜0.01).In vitro experiment,compared with the wild A549 cells,the expressions of COL1A1,COL1A5 and SOX4 were decreased in the miR-630-transfected A549 cells(P＜0.01).The migration activity of A549 cells was decreased after transfected with miR-630(P＜0.01).The Luciferase activity of the SOX4-3′-UTR plasmid was significantly suppressed by miR-630(P＜0.00). Conclusion The expression of miR-630 is down-regulated in lung adenocarcinoma;miR-630 inhibits migration and invasion ofA594 cells,indicating that SOX4-3′-UTR may be its targeting gene.