宁波地区非综合征型耳聋患儿耳聋基因热点突变筛查分析

高薇薇 卢文翔 张雷 白云飞

宁波地区非综合征型耳聋患儿耳聋基因热点突变筛查分析

高薇薇 卢文翔 张雷 白云飞

目的 筛查分析宁波地区非综合型耳聋(NSHL)患儿耳聋基因热点突变情况，了解该地区耳聋患儿分子流行病学特征。方法 选取宁波市特殊教育中心就读的重度、极重度NSHL患儿168例，应用遗传性耳聋基因检测试剂盒，采用多重突变阻滞扩增系统毛细管电泳检测技术进行4个遗传性耳聋基因的29个位点的突变筛查。 结果 本研究NSHL患儿中检出耳聋基因热点突变58例（34.52%），其中单一GJB2基因热点突变者43例，单一SLC26A4基因热点突变者9例，GJB2基因合并SLC26A4基因热点突变者3例，12S rRNA基因热点突变3例；GJB2、SLC26A4、12S rRNA基因热点总突变率分别为27.38%、7.14%和1.79%。在所有热点突变中，以GJB2 235delC突变率最高（23.21%），其次是GJB2 299 del AT（5.36%）。 结论 宁波地区NSHL患儿热点突变耳聋基因以GJB2基因和SLC26A4基因为主，且GJB2 235delC是最常见突变位点。

遗传性耳聋 非综合征型耳聋 热点突变 基因诊断

我国每年患各种出生缺陷和先天残疾的新生儿中，听力残疾是最常见，也是最严重的，其中遗传因素导致的听力残疾超过半数。遗传性耳聋按表型不同可分为综合征型耳聋（syndromic hearing loss，SHL）和非综合征型耳聋（nonsyndromic hearing loss，NSHL）。NSHL是指只有听力损害，不伴有耳外组织的异常和病变，约占遗传性耳聋的70%。国内大规模的耳聋分子流行病学调查显示，在NSHL患者中存在几个热点突变：GJB2基因突变、GJB3基因突变、线粒体12S RNA和SLC26A4基因突变[1]。这些热点突变的发现为我国开展耳聋基因突变的筛查、诊断及阻断提供了理论基础。本研究对宁波地区NSHL患儿进行了4个遗传性耳聋基因的29个位点的突变筛查，以了解该地区NSHL患儿耳聋基因热点突变谱系及发生频率，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2015年7月至2016年12月在宁波市特殊教育中心及其附属幼儿园（鄞州区小雨点听力语言康复中心）就读的具有完整听力学资料的重度、极重度耳聋患儿168例，排除各类SHL及急慢性中耳炎、听神经性瘤、耳外伤等有明显原因致聋的患儿。经问卷调查及体格检查，全部患儿为NSHL，其中男87例，女81例；年龄3～16（11.22±4.10）岁。本研究患儿均接受了耳聋基因检测，并取得患儿及患儿家长的知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器 AGCU遗传性耳聋基因检测试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司），磁珠法DNA提取试剂盒（长春市博坤生物科技有限公司），去离子甲酰胺（美国ABI公司），POP4胶（美国ABI公司），Life Pro扩增仪（杭州博日科技有限公司），3130XL型遗传分析仪（美国ABI公司）。

1.2.2 DNA样本的采集 先在干净的15ml离心管上空白位置和管盖上作好耳聋患儿代号标记。耳聋患儿在取样前30min内停止进食。采样人员用消毒棉签轻轻刮取患儿口腔舌下及双侧颊黏膜口腔上皮细胞，轻轻地旋转或刮动10次左右以保证获得足够的DNA，采集过程中注意避免用手触及棉签；采集完成后置于空气中风干片刻，再放回离心管并封口。

1.2.3 检测方法 采用磁珠法提取DNA。每例棉签样本用小剪刀剪取少量，可被150μl裂解液淹没即可，提取的DNA直接用于PCR扩增。PCR扩增体系组成：Reaction Mix 5.0μl+Primers 2.0μl+热启动C-Taq酶0.3μl+模板（磁珠法提取）1.0μl+sdH2O 1.7μl。PCR扩增程序：预变性95℃5min，94℃1min、60℃1min、72℃1min（循环30次），终延伸72℃20min。

1.2.4 热点突变筛查 采用多重突变阻滞扩增系统毛细管电泳检测技术筛查。取1μl PCR产物与10μl去离子甲酰胺和AGCU Marker SIZ-500混合物混匀，采用3130XL型遗传分析仪检测（进样电压3KV，时间10s），结果采用GeneMapper v3.2软件进行分析。筛查4个遗传性耳聋基因的29个位点的突变，包括GJB2基因（9、35、167、176、235、299、155、424、512）、GJB3基因（538、547）、SLC26A4基因（281、589、707、IVS7－2、1174、1226、1229、1238、1336、1548、1829、1975、IVS15+5、2027、2168）和12S rRNA基因（1494、1555、12201）。

2 结果

2.1 168例NSHL患儿耳聋基因热点突变分析 本研究NSHL患儿中检测到耳聋基因热点突变者58例（34.52%），其中单一GJB2基因热点突变者43例，单一SLC26A4基因热点突变者9例，GJB2基因合并SLC26A4基因热点突变者3例，12S rRNA基因热点突变3例。GJB2基因热点总突变率为27.38%（46/168），SLC26A4基因热点总突变率为7.14%（12/168），12S rRNA基因热点总突变率1.79%（3/168）。在上述所有热点突变中，GJB2 235delC突变率最高，为23.21%（39/168）；其次是GJB2 299 del AT，为5.36%（9/168）；SLC26A4 1226G＞A、2168A＞G以及12S rRNA 1555A＞G突变率均为1.79%（3/168）；本研究患儿未检出GJB3基因突变。168例NSHL患儿耳聋基因热点突变分析见表1。

表1 168例NSHL患儿耳聋基因热点突变分析

2.2 58例耳聋基因突变NSHL患儿突变热点分析 由表2可见，46例GJB2基因热点突变NSHL患儿中GJB2基因单个热点突变的患者39例，分别为235delC纯合突变21例，235delC杂合突变11例，299-300delAT杂合突变5例，176del16杂合突变1例，35delG杂合突变1例；GJB2基因2个突变热点的患者4例，分别是299delAT/235delC复合杂合突变3例，176del16、235delC复合杂合突变1例；GJB2基因与SLC26A4基因复合突变的患者3例，分别是GJB2 235delC纯合突变合并SLC26A4 1180delTTC杂合突变1例，GJB2 235delC杂合突变合并SLC26A4 2168A＞纯合突变1例，GJB2 299delAT/235delC杂合突变合并SLC26A4 2168A＞G杂合突变1例。

12例SLC26A4基因热点突变NSHL患儿中，与GJB2基因复合突变3例，SLC26A4基因单一热点突变9例：919A＞G纯合突变1例，1975G＞C纯合突变1例，杂合突变1例，1226G＞A杂合突变3例，2168A＞G杂合突变1例，1229C＞T杂合突变2例。

3例 12S rRNA基因热点突变 NSHL患儿中，1555A＞G均质性突变2例，1555A＞G异质性突变1例。其中2例1555A＞G均质性突变患儿为出生后用药致聋，另1例异质性突变患儿为先天性聋。

表2 58例耳聋基因突变NSHL患儿突变热点分析（例）

3 讨论

遗传因素能够影响耳聋的发生、发展，通过确定耳聋患者及高危人群的遗传因素，给予正确的指导及干预措施，可一定程度上预防耳聋新发及加重。目前发现的耳聋基因众多，突变谱广泛，国内NSHL患者耳聋基因热点突变的确定为寻找国内多数NSHL的病因指明了方向。

GJB2基因突变会导致耳蜗中的细胞缝隙连接中断，导致听觉功能失常。目前约有50%的常染色体隐性遗传NSHL存在该基因耳聋突变[2]。GJB2基因突变导致的听力损失多表现为先天性、双侧对称性、非进行性重度或极重度耳聋。GJB2基因的突变几乎覆盖整个编码区，其突变位点具有明显的种族差异性，欧美人群中GJB2基因突变最多见为30delG或 35delG的热点突变[3]，纪育斌等[4]2011年通过对国内GJB2基因突变流行病学文献的荟萃分析认为国内GJB2总体致病突变率为12.88%，总体突变率为19.41%。彭新等[5]报道扬州地区278例NSHL的GJB2基因突变率为31.7%，致病突变率为23.4%。张迪等[6]报道内蒙古自治区355例NSHL患者GJB2基因突变率为14.93%；GJB2基因具有多种突变方式，国内多项耳聋分子流行病学调查研究表明，GJB2基因以235delC突变最常见，其次为 299delAT、176del 16，而35delG突变少见。戴朴等[7]对1 680例NSHL患者进行耳聋分子流行病学研究，发现GJB2 235delC突变率较高，为18.16%。于飞等[8]研究提示国内不同地区NSHL患者235delC突变率为6.59%～25.18%。杨雪等[9]报道贵州省356例NSHL患者GJB2基因最常见突变位点是235delC。本研究结果显示，宁波地区NSHL患儿GJB2基因致病突变率为13.01%（22/168），突变率为27.38%（46/168），表明宁波地区耳聋基因突变以GJB2突变最普遍；本研究结果显示235delC突变率最高，为23.21%，突变率明显高于GJB2其他位点，其中纯合突变有22例，杂合突变有17例，说明235del也是宁波地区NSHL患儿中最常见的突变位点。

SLC26A4基因突变可引起NSHL及SHL。在NSHL中，SLC26A4基因与常见的一种内耳畸形-大前庭导水管综合征的发病有直接因果关系，国内各地区有关SLC26A4基因突变率的报道并不一致：梁鹏飞等[10]报道陕西省 800例NSHL患者SLC26A4基因突变率为18.88%；刘水霞等[11]报道广西地区127例NSHL患者SLC26A4基因突变率为2.36%；牟书瑜等[12]报道大连地区5 266例耳聋患者中SLC26A4基因突变率为9.72%。不同种族人群中SLC26A4基因突变谱不同，国内SLC26A4基因突变热点主要是IVS7-2A＞G：袁永一等[13]对国内2 352例重度、极重度耳聋人群进行了SLC26A4基因全序列分析，发现IVS7-2A＞G位点突变率达到11.52%；何本超等[14]对湖北天门市52例聋哑儿童基因检测发现SLC26A4基因突变率为17.30%，以IVS7-2A＞G位点突变最为常见。本研究结果显示SLC26A4基因热点突变率为7.14%（12/168），其中纯合突变3例，分别是1975G＞C、919A＞G和2168A＞G，此3例患儿临床诊断均为大前庭导水管综合征，其它热点突变为杂合突变，分别为1975G＞C、2168A＞G、1226G＞A和1229C＞T，并未发现国内报道最多的IVS 7-2 A＞G突变。除了选择对象的不同，推测可能确实存在地区间的差异。受实验条件限制，由于此基因的遗传特性，双等位基因突变可以导致耳聋表型的发生，对单杂合突变和复合杂合突变的耳聋患者，检测结果受目前耳聋基因突变位点数目及种类的限制，不能检出全部已知SLC26A4基因突变位点，所以SLC26A4基因单杂合突变患者应进一步做基因测序明确病因。

线粒体12S rRNA基因突变跟母系遗传有关，该突变携带者应用氨基糖苷类药物可造成不可逆的听力损害。目前，mtDNA12S rRNA A1555G点突变导致的药物性耳聋已成为公认的突变致聋位点，纪育斌等[15]综合16篇研究对象为NSHL患者的文献数据，初步得出中国患者A1555G突变率为6.62%（230/3473）。本研究结果显示12S rRNA突变率为1.79%（3/168），低于国内其他报导，其中2例为1555 A＞G均质性突变，此2例患儿均为出生后用药致聋；另1例为异质性突变，该患儿致聋病因与其有一定相关。目前在对这3个患儿母系家庭成员进行相关调查，拟行基因突变的筛查，找出携带该基因突变的氨基糖苷类药物敏感听力正常个体，通过科普宣教、指导用药、遗传咨询、产前诊断等干预措施，能阻断该基因突变在此类家族中继续传递。

总之，耳聋基因热点突变筛查对于耳聋阻断意义重大。对多数耳聋患者可以从分子学进行诊断，利用基因快速检测技术筛查耳聋人群和突变基因携带者，通过产前诊断技术预防后代耳聋的发生。

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Screening of hot-spot deafness gene mutations among children with non-syndromic hearing loss in Ningbo region

GAO Weiwei,LU Wenxiang,ZHANG Lei,et al.Ningbo College of Health Sciences,Ningbo 315800,China

Hereditary hearing loss Non-syndromic hearing loss Hot-spot mutation Genetic diagnosis

2017-03-19）

（本文编辑：李媚）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.12.2017-595

浙江省教育厅科研项目（Y201534685）

315100 宁波卫生职业技术学院（高薇薇）；无锡中德美联生物技术有限公司研发部（卢文翔）；浙江大学明州医院耳鼻咽喉科、浙江大学医学院附属邵逸夫医院耳鼻咽喉头颈外科（张雷）；东南大学分子电子学国家重点实验室（白云飞）

高薇薇，E-mail：wiwi_g@163.com

【 Abstract】 Objective To screen the hot-spot deafness gene mutation in children with non-syndromic hearing loss (NSHL)in Ningbo region. Methods One hundred and sixty eight NSHL children were enrolled from Ningbo Special Education Center for the study.The screening of 29 hot-spot mutations of 4 deafness genes was performed by multiple ARMS capillary electrophoresis using AGCU genetic deafness gene detection kit. Results Among 168 children,the deafness gene mutations were detected in 58 cases (34.52%),including 43 cases with single hotspot mutation in GJB2 gene,9 with hotspot mutations in single SLC26A4 gene,and 3 with GJB2 gene and SLC26A4 gene mutation,and 3 with 12S rRNA gene mutation.The total hot spot mutation rate of GJB2 gene was 27.38%,that of SLC26A4 gene was 7.14%,and that of 12S rRNA gene was 1.79%.The mutation rate of GJB2 235delC was the highest(23.21%),followed by GJB2 299 del AT(5.36%)in all hotspots. Conclusion GJB2 and SLC26A4 are the main genes associated with non-syndromic deafness patients in Ningbo area,and GJB2 235delC is the most common mutation site.