高通量测序技术对自然流产的遗传学价值*

杨小风，郭婷婷，归 婧，王雅莉

(郑州大学附属郑州中心医院 ，郑州 450007)

临床医学

高通量测序技术对自然流产的遗传学价值*

杨小风，郭婷婷，归 婧，王雅莉△

(郑州大学附属郑州中心医院 ，郑州 450007)

目的 观察高通量测序技术检测自然流产组织及遗传因素对自然流产的影响。方法 选择91例自然流产患者，孕6～29周。取流产组织(绒毛或胚胎组织)，提取组织DNA，采用高通量测序技术对样本基因组信息进行分析解读，并与传统的染色体核型分析进行对照，统计染色体异常的类型及所占比率。结果 91例自然流产患者绒毛或胚胎组织处理后经高通量基因测序异常33例，染色体数目异常24例，100 Kb以上片段缺失/重复 9例，其中6例为多态覆盖区域；传统染色体核型成功分析89例，高通量基因测序结果与其中82例结果一致，符合率为92.00%(82/89)。结论 与染色体核型分析技术相比，高通量测序技术对复发性流产患者流产组织的遗传学检查具有更高的敏感性、高效性、特异性，具有临床实际应用价值。

自然流产；绒毛；高通量测序；染色体异常

随着社会压力、环境、物理化学、精神心理等因素的影响，自然流产的发病率日益增加,怀孕早期自然流产高达25%[1],导致自然流产的因素有遗传、内分泌、免疫及母亲宫腔的解剖结构、环境等，其中近60%是由染色体异常引起[2]。传统的细胞学培养检查虽是金标准，但对样本要求较高，且存在耗时、检出率低下的局限[3]。高通量测序技术结合生物信息学分析技术可在24 h内获得23对染色体的大量碱基信息，可发现100 Kb以上染色体微缺失、微重复和非整倍体改变等染色体异常，与传统染色体核型分析技术相比具有更高的检测成功率、高效性，对染色体结构异常具有更高的敏感性，加快了早期流产遗传因素的确定，使得早期流产的病因学诊断更加全面和深入[4]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年1月—2015年9月在郑州中心医院妇产科就诊的自然流产患者91例，年龄21～40( 27.65±5.00)岁，孕龄6～29 周，并有1次或以上的孕产史，在知情同意的原则下无菌获取绒毛组织，进行高通量测序分析，同时进行绒毛组织细胞培养染色体核型分析。

1.2 方法

1.2.1 样本DNA提取 取新鲜冷冻过的流产组织，选取绒毛组织10 mg，按照 《血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒》操作说明提取基因组DNA，用分光光度计(Nanodrop，美国)检测DNA浓度及纯度，质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

1.2.2 基因文库的构建及DNA测序 将提取的基因组DNA在超声打断仪上打断成小片段核酸，采用酶反应对打断后的基因组DNA片段进行末端修复，将DNA片段3’端碱基“A”与5’端碱基“T”接头对接。通过PCR扩增进行富集。用磁珠纯化的方法对PCR扩增后的DNA文库纯化，去除反应体系中引物二聚体等干扰，得到DNA小片段文库。应用Hise2000测序平台，将通过质控的DNA文库按照染色体异常分析所需的数据量进行上机，在Illumina Genome Analyzer上测序。

1.2.3 数据分析 高通量测序结果通过对比软件将每个测序Reads匹配到其所在的染色体上。随后做相应标准化Z值分析，通过Z值进行染色体异常判定。

1.2.4 绒毛染色体核型确诊方法 取适量无菌绒毛标本用生理盐水洗3遍，剪碎，分2瓶接种于5 ml Ammiomax完全培养基，培养4～5 d，常规消化法收集细胞、制片、吉姆萨染色，镜下计30个分裂象，分析3～5个核型，异常计数加倍。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件分析数据，计数资料以频数、构成比成率表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高通量基因测序结果和组织细胞染色体核型分析结果比较 91例患者中33例患者高通量基因测序结果异常。高通量基因测序检测成功率100%(91/91)，而传统的组织细胞培养成功率为97.8%(89/91)，样本污染检测失败2例,后经高通量测序检测1例正常，另1例为常染色体第11号染色体长臂缺失。两种方法均检测成功的89例中，82例结果完全一致，符合率92%(82/89)。高通量基因测序染色体异常核型检出率100%(33/33)，而染色体核型分析异常检测率为78.8%(26/33)。虽然高通量基因染色体异常检测率高于传统染色体分析，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1-2。

2.2 绒毛或胚胎染色体非整倍体的发生与孕妇年龄的关系 91例样本按年龄分成2个亚组(①组≤34岁。②组：35～40岁)，比较各组间染色体异常发生率。结果显示②组染色体异常发生率高于①组，差异有统计学意义(χ2=21.21,P<0.01)，且②组中三体型和性染色体单体型高于①组，差异有统计学意义(χ2=7.37,P<0.01)。提示随着孕妇年龄增加，染色体异常比率增加。见表3。

表1 33例高通量基因测序结果异常样本

表2 高通量测序方法和传统染色体核型分析方法的结果比较[n(%)]

表3 不同年龄段异常核型构成情况

3 讨论

胚胎的染色体异常是导致胚胎停止发育而发生流产的重要原因，有研究[5]指出因染色体数目异常引发的自然流产达23%～61%[5]。目前临床应用较广的传统染色体核型分析技术对组织样本要求高，培养周期长且存在培养失败风险。因此，找出一种快速、准确地检测自发流产组织染色体异常的方法，从而合理指导临床妊娠有重要作用。

第二代测序技术(next-generation sequencing technology)为代表的高通量测序技术最大特点是测序高度平行化，即成千上万个测序反应可在一个平台同时进行。结合生物信息学分析，一次性覆盖23对染色体，减少了传统染色体核型分析中细胞培养过程，可以发现100 kb以上染色体的缺失和重复。对样本要求低，可对污染、冻存标本进行检测，取材方便，检测周期短，对微小片段的缺失、重复检出率高，弥补了传统染色体核型分析、FISH技术、CGH的不足[6～8]。

该研究运用高通量测序技术对91例自发流产者的绒毛或胚胎组织进行快速检测，筛查染色体，检测成功率100%，检出率为36.3%(33/91)，传统染色体核型检测成功率97.8%，均明显高于文献报道的传统染色体核型的异常检出率66.0%[9]。

随着孕妇年龄增大，孕妇卵巢功能老化，雌激素、黄体酮水平降低，导致卵泡纺锤体老化，卵细胞在减数分裂过程错误分离率增高，染色体三体发生率随之增高。在该次高通量测序检出的33例样本中，数目异常占72.7%(24/33)，最常见的染色体异常类型是三体型，主要包括16-三体、21-三体、13-三体等，此外还有部分结构异常和单体型。这些发现与Yakut[10]研究结果相符。孕妇孕中和新生儿检测中最常见三体是21-三体，21-三体占染色体异常的比例随孕妇年龄的增大而增高[11]。而16-三体是自发流产中最常见的三体类型[12]，因此又称16号染色体为“流产性染色体”。常染色体三体中，最常见的还有8、9、10、13、15、22号等染色体，性染色体三体在自发流产中较常见。此外高龄孕妇中异常染色体尤为多见，孕双或多三体孕妇的平均年龄是35.6岁。该研究发现，35岁以上孕妇自然流产中染色体异常率为80%(16/20)，明显高于35岁以下孕妇。因此，35岁以上孕妇在做产前评估时相比较35岁以下孕妇应更详尽。国外研究[13]发现的第一例双三体是唐氏-克氏双三体综合征，之后又陆续发现了385例双三体[13]。双三体在自发流产中的检出率为1.2%,不同机构双三体的检出率在0.80%～2.64%[14]间。该研究中双三体的检出率为1.1%(1/91)，与文献报道相符。

在流产组织样本检测过程中，发现染色体异常对自发流产原因的分析有重要价值。高通量测序技术在较短的时间内给予病因学诊断，对检测出自发流产组织及其父母携带有染色体结构异常的家庭，给予其适当的遗传咨询，预测再次妊娠流产风险，同时给予科学的孕育指导，对于早期流产的预防和治疗有重要作用。

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[责任编辑：张亚光]

Genetical Value of Spontaneous Abortion by High-through Sequencing Technology

YANG Xiao-feng, GUO Ting-ting, GUI Jing, WANG Ya-li

(ZhengzhouCentralHospital,ZhengzhouHenan,450007,China)

Objective To perform high throughput sequencing diagnosis of chromosome by detecting natural abortion villus, explore the effects of genetic factors on abortion and provide clinical guidance for next pregnancy.Methods 91 patients with spontaneous abortion, gestational age among 6-29 weeks were chosen, follow the principle of informed consent, take abortion group (villi and fetal tissues), extract DNA, using high-through sequencing technologies to analyze samples of genome information interpretation. And the authors carried on the contrast analysis with traditional karyotype analysis, statistical type and proportion of chromosomal abnormalities. Results In 33 cases out of 91 spontaneous abortion or embryonic tissue villus, high-through sequencing technology revealed abnormalities, 24 cases of abnormal number of chromosomes, 100Kb above fragment deletion / duplication nine cases, including six cases of multi-state coverage area; the successful analysis of the traditional karyotype 89 cases, high-through gene sequencing results were consistent with the results of 82 cases in which, in line with the rate of 92% (82/89).Conclusion With the traditional “gold standard”-karyotype analysis technology, compared to the high-through sequencing technology has higher sensitivity, efficiency, specificity and has clinical application value.

spontaneous abortion; villus; high-through sequencing; chromosome abnormality

2016-12-05

自然流产组织染色体检测的临床研究(20140451)。

杨小风(1976-)，女，河南省孟津县人，硕士，副主任医师，从事妇产科临床工作。

△通信作者：王雅莉，E-mail: zxyyfuchanke@163.com。

R 719.3

A

1008-9276(2017)02-0110-04