漂浮固化分散液液微萃取-UHPLC-MS/MS法测定水产品中丁香酚的残留量

孙 鹏，高玉玲，王金梅，刘秀娟

(1.黑龙江八一农垦大学测试中心，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江大学化学化工与材料学院，黑龙江 哈尔滨 150080；3.大庆石化公司质量检验中心，黑龙江 大庆 163711)

漂浮固化分散液液微萃取-UHPLC-MS/MS法测定水产品中丁香酚的残留量

孙 鹏1,2，高玉玲1，王金梅3，刘秀娟3

(1.黑龙江八一农垦大学测试中心，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江大学化学化工与材料学院，黑龙江 哈尔滨 150080；3.大庆石化公司质量检验中心，黑龙江 大庆 163711)

建立了漂浮固化分散液液微萃取(DLLME-SFO)前处理技术，结合超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)法测定水产品中丁香酚的残留量。通过考察萃取剂种类、萃取剂体积、分散剂种类、分散剂体积、氯化钠质量分数、萃取时间、离心温度对萃取效率的影响，确定了最佳萃取条件，即以30 μL 1-十一醇为萃取剂，800 μL 乙醇为分散剂，氯化钠质量分数为6%，于-3 ℃下以10 000 r/min离心5 min，将液体部分移除，待固体融化后取20 μL 供UHPLC-MS/MS分析。结果表明，在5～500 μg/kg范围内，丁香酚的线性关系良好，相关系数为0.999 6，回收率在88.9%～103.4%之间，方法检出限和定量限分别为1.47 μg/kg和4.91 μg/kg，日内相对标准偏差(RSD)均低于7.5%(n=6)，日间相对标准偏差(RSD)均低于9.8%(n=3)。该方法操作简单，溶剂用量少，快速、安全、重现性好，适用于水产品中丁香酚残留的分析。

漂浮固化液液微萃取(DLLME-SFO)；超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)；丁香酚；水产品；残留；麻醉剂

丁香酚(C10H12O2)具有麻醉、松弛肠平滑肌、解热、抗炎、抗过敏等作用[1]。将丁香酚添加到鲜活水产品中，可以麻醉动物神经，令其暂时失去活力从而减少因应激性反应造成的缺氧或皮肤损伤[2]。例如，经销商在运输过程中往往会用丁香酚等麻醉剂对活鱼进行麻醉，减少活鱼碰伤的情况，保证其外观完整，减少经济损失[3]。但是，这些化学物质会被鱼类吸收，间接危害消费者的身体健康和生命安全，不利于水产经济的健康发展[4]。

欧盟、美国均未规定水产品中丁香酚的限量，但日本肯定列表中允许使用丁香酚作为麻醉剂，规定其最高限量为50 μg/kg。我国对丁香酚类化合物残留方面的限制还处于空白阶段，因此建立简便、高效、准确的水产品中丁香酚测定方法迫在眉睫。

目前检测丁香酚残留的方法主要有气相色谱法[5]、高效液相色谱法[6-8]、气相色谱-串联质谱法[9]、液相色谱-串联质谱法[10]、高效毛细管电泳法[11]等。在这些方法中，均采用传统的液液萃取法进行样品前处理，存在有机溶剂用量大、检出限高、分析时间长等不足。液液微萃取是近年来发展的样品前处理技术，以消耗试剂少、简单、廉价等优点广泛应用于农残[12-14]、兽残[15-16]的检测中。

漂浮固化分散液液微萃取技术(DLLME-SFO)[17-18]可通过冷冻凝固操作使漂浮的萃取剂和水相分离。该技术增加了DLLME 萃取剂的种类，拓展了 DLLME 的应用范围，操作简便快速。本研究拟采用漂浮固化液液微萃取样品前处理技术，结合超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定水产品中丁香酚残留，希望为今后水产品中丁香酚限量标准的制订提供参考依据。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

1290-6460型超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪：美国Agilent公司产品，配有ESI、APCI离子源及MassHunter 6.0数据处理系统；IKA T25型高速组织匀浆机：德国IKA仪器设备有限公司产品；SK8200H型超声波清洗机：上海科导超声仪器有限公司产品；Z36HK型高速冷冻离心机：德国Hermie公司产品；Vortex-2型涡旋仪：美国SI Digital公司产品。

1.2 材料与试剂

丁香酚对照品：纯度大于99.0%，由农业部环境保护科研监测所提供；1-十一醇：纯度为99.5%，阿拉丁试剂(中国)有限公司产品；正十六烷：纯度为99%，Sigma-Aldrich公司产品；甲醇、乙醇、乙腈、丙酮：均为色谱纯，德国 Fisher公司产品；250 μL内插管：美国Agilent公司产品；NaCl：优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司产品，使用前烘干至质量恒定；0.22 μm微孔滤膜：天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；实验用水：市售4.5 L屈臣氏蒸馏水；河蟹、对虾、鲤鱼：均购于大庆市东安市场，取可食部分经高速组织捣碎机处理后备用。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Endeavorsil C18柱(30 mm×2.1mm×1.8 μm)；流动相：甲醇-水溶液(80∶20，V/V)，等度洗脱；柱温：24 ℃；流速：0.30 mL/min；进样量：5 μL。

1.3.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，负离子多反应监测(MRM)模式；干燥气、雾化气、鞘气均为氮气，碰撞气为高纯氮气；干燥气：温度300 ℃，流速5.1 L/min；鞘气：温度250 ℃，流速11.0 L/min，鞘气喷嘴电压500 V；毛细管电压：3 500 V。

1.4 实验方法

准确称取0.20 g样品于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入3 mL乙腈，以10 000 r/min均质1 min，加入1 g氯化钠，涡旋振荡1 min；静置后将上清液转移至另一聚四氟乙烯离心管中，分别加入5 mL水，30 μL 1-十一醇(萃取剂)，800 μL乙醇(分散剂)，6%(质量分数)氯化钠，旋紧塑料旋塞，涡旋振荡3 min后，于-3 ℃下以10 000 r/min离心5 min，取出离心管，除去液体部分；在室温下，待融化后用微量进样器取20 μL样品，加入250 μL内插管中，供UHPLC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

2.1.1 萃取剂的选择 选择合适的萃取剂是提高萃取效率的关键，萃取剂需具备密度小于样品水溶液，且水溶性小、不易挥发、对分析物具有良好的萃取能力和色谱行为等特点。基于以上几点，本实验考察了1-十一醇(熔点19 ℃)和正十六烷(熔点18.2 ℃)2种萃取剂。通过实验比较，1-十一醇对丁香酚有较好的回收率，故选择1-十一醇为萃取剂。

实验还考察了1-十一醇萃取剂的用量分别为10、20、30、40、50 μL时对丁香酚萃取效率的影响，结果示于图1。当萃取剂为10 μL时，回收率最低，随着1-十一醇用量的增加，萃取回收率不断提高；当加入30 μL 1-十一醇时，萃取回收率达到最大值并趋于稳定，故本实验选择萃取剂用量为30 μL。

图1 萃取溶剂体积和种类对萃取回收率的影响Fig.1 Effect of volume and type of extraction solvent on recoveries

2.1.2 分散剂的选择 分散剂的选择影响萃取微滴及最终萃取相体积，进而影响萃取效率。分散剂需要与萃取剂和样品水溶液具有很好的混溶性，同时不影响样品混合溶液在分层时形成两相，不干扰目标化合物分析，且具有良好的色谱行为。本实验分别考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮作为分散剂对丁香酚回收率的影响，结果示于图2。由图2可见，乙腈、丙酮作为分散剂时的萃取回收率都较低，而乙醇作为分散剂时的萃取效率最高，故本实验选择乙醇为分散剂。

图2 分散剂体积和种类对萃取回收率的影响Fig.2 Effect of volume and type of dispersion solvent on recoveries

分散剂体积的大小影响萃取剂在水相中的分散程度。分散剂体积较小时，萃取剂不能均匀地分散在水相中；分散剂体积较大时，分析物在水中的溶解度增大，不易被萃取。实验考察了分散剂体积分别为200、400、600、800、1 000 μL时对萃取效率的影响。结果表明，当分散剂体积为800 μL时，萃取效率最高。

2.1.3 氯化钠质量分数的选择 氯化钠的加入可以增大水相的离子强度，提高目标化合物在有机相的萃取效率。本实验考察了氯化钠质量分数为2%～10%时的萃取效率，结果示于图3。结果表明，随着氯化钠质量分数的增加，萃取效率逐渐提高，当氯化钠质量分数在6%时，萃取效率最佳。

2.1.4 萃取时间和离心温度的选择 萃取时间是指往样品水溶液中加入萃取剂和分散剂后至混合溶液离心前的时间。萃取平衡的建立需要一定的时间，实验分别考察了萃取1、2、3、4、5 min对萃取效率的影响。结果表明，涡旋振荡时间大于2 min，萃取效率可达到稳定状态，故选择涡旋振荡时间3 min。离心是为了使萃取剂相与水溶液分离，离心温度会影响萃取剂固化时间及效果，最终影响萃取效率。 通过考察离心温度对实验及回收率的影响发现，温度过低、时间过长，不仅萃取剂会固化，整个样品溶液也有固化的趋势；温度过高，萃取剂固化在分离水相时容易破碎，不易分离。综合考虑，本实验选择于-3 ℃下离心5 min。

图3 NaCl质量分数对回收率的影响Fig.3 Effect of NaCl massfraction on recoveries

2.2 实验条件的优化

2.2.1 质谱条件的优化 配制10 μg/L丁香酚标准溶液，在ESI-模式下，以甲醇、水为流动相时，丁香酚在水中失去氢离子，形成较强响应的[M-H]-准分子离子峰。选取[M-H]-(m/z163.1)为母离子，选择MS2SIM以优化质谱的碎裂电压，最终确定碎裂电压为90 V。选择子离子对其碰撞能进行优化，二级质谱扫描，选取二级质谱中没有干扰、信号相对较强的2个特征碎片离子与其母离子组成两对离子对。本研究选择丰度最强、受干扰较小的m/z163.1/148.1为定量离子对，其碰撞能为20 eV；选择m/z163.1/121.1为定性离子对，其碰撞能为32 eV。在MRM模式下，得到丁香酚标准品的总离子流图，示于图4。

2.2.2 超高效液相色谱条件的优化 在ESI-模式下检测丁香酚，实验比较了流速分别为0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL/min时，丁香酚的峰形及响应强度等指标，最终确定最佳流速为0.30 mL/min。实验还考察了22、24、26、28、30 ℃等不同温度对待测物峰形及响应强度的影响，结果表明，随着温度的升高，待测物的保留时间有所下降，但对其峰形及响应强度的影响不大，故实验选择温度为24 ℃。

图4 丁香酚标准品的总离子流图Fig.4 Total ion chromatogram of eugenol reference standards

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系、检出限和定量限 在优化的实验条件下，向阴性对虾样品中分别添加含量为1、5、20、50、100、250、500、1 000 μg/kg的标准储备液进行DLLME-SFO-UHPLC-MS/MS

测定，根据峰面积(A)与加标样品中丁香酚的含量(C，μg/kg)绘制工作曲线。结果表明，在5～500 μg/kg范围内，丁香酚保持良好的线性关系，经仪器软件拟合基质标准曲线的线性方程为A=3.359 216C+68.076 739，相关系数为0.999 6。以最小添加水平色谱图中3倍信噪比确定各农药的检出限(LOD)，10倍信噪比确定其定量限(LOQ)，丁香酚的LOD和LOQ分别为1.47 μg/kg和4.91 μg/kg。

2.3.2 方法回收率和精密度 在阴性对虾、河蟹、鲤鱼样品中分别加入含量为2、5、10 μg/kg的丁香酚，检测得到方法的回收率及日内、日间精密度，结果列于表1。由表1可知，方法的回收率在88.9%～103.4%之间。日内精密度以1天内平行分析6次加标样品所得回收率的RSD表示，日间精密度以每天分析加标样品连续分析3天所得回收率的RSD表示。由表1可知，日内相对标准偏差均低于7.5%(n=6)，日间相对标准偏差均低于9.8%(n=3)，说明该方法的准确性和重现性较好。

表1 丁香酚的回收率和方法精密度Table 1 Recoveries and RSDs of the eugenol spiked in aquatic at three levels

2.4 样品分析

在优化的实验条件下对水产品样品及加标样品进行DLLME-SFO-UHPLC-MS/MS分析，从河蟹样品(A)、对虾样品(B)、鲤鱼样品(C)中均未检出丁香酚，实验结果示于图5。

注：a.河蟹样品；b.对虾样品；c.鲤鱼样品；d.加标样品图5 水产品样品及加标样品的MRM图Fig.5 MRM Chromatogram of aquatic products samples and spiked samples

3 结论

本研究建立了漂浮固化液液微萃取-超高效液相色谱-串联质谱测定水产品中丁香酚残留量的方法，该方法前处理简单、分析时间短，大大提高了检测效率，其灵敏度、准确度、回收率和精密度均能满足兽药残留检测要求，可为相关标准方法的制订提供参考依据。

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Determination of Eugenol Residue in Aquatic Using Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Based on the Solidification of a Floating Organic Droplet Followed by UHPLC-MS/MS

SUN Peng1,2, GAO Yu-ling1, WANG Jin-mei3, LIU Xiu-juan3

(1.TestingCentre,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China;2.SchoolofChemistryandMaterialsScience,HeilongjiangUniversity,Harbin150080,China;3.InspectionCenterofDaqingPetrochemicalCompany,Daqing163711,China)

A novel dispersive liquid-liquid microextraction based on solidification of floating organic droplet (DLLME-SFO) followed by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) was developed for the determination of eugenol residue in aquatic. The influence of extraction parameters including types of extraction solvent, volume of extraction solvent, vortex extraction time, sodium chloride mass fraction, chromatographic condition and mass spectrometry condition were investigated. The optimal liquid-liquid microextraction experiment conditions were as follows: 30 μL 1-undecanol as extraction solvent, 800 μL of methanol as disersive solvent, sodium chloride mass fraction 6%, vortex oscillation extrantion time 3 min, centrifugal time was 5 min with 10 000 r/min at three degrees below zero centigrade, dislodge water phase, after thawed it was analyzed by UHPLC-MS/MS. The analytical column was DIKMA Endeavorsil C18(30 mm×2.1 mm×1.8 μm), and the mobile phase was composed of methanol-water solution (80∶20,V/V). The flow rate was 0.30 mL/min and run time was 2.0 min. A tandem mass spectrometer coupled with negative electro-spray ionization (ESI) source was used for detection. The quantitative detection was performed on UHPLC-MS/MS by multiple reaction monitoring (MRM) mode under negative electro spray ionization (ESI-). It was shown that good linearity is obtained at the concentrations of 5.0-500.0 μg/kg with the correaltion coefficients higher than 0.999 6 for eugenol. The recovery is 88.9%-103.4%. The limits of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for eugenol are 1.47 μg/kg and 4.91 μg/kg, respectively. The intra-day relative standard deviations are lower than 7.5%(n=6), and the inter-day relative standard deviations are lower than 9.8%(n=3). MRL of eugenol in aquatic product was not demanded in China. Therefore, analytical of eugenol content in different aquatic products is of considerable importance and requires the development of precise methods for its determination imperatively. The method is efficient, solvent saving, reliable and sensitive, and can be suitable for the determination of eugenol residue in aquatic.

dispersive liquid-liquid microextraction based on solidification of floating organic droplet (DLLME-SFO); ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS); eugenol; aquatic; residue; anesthetic

2016-06-20;

2016-09-26

大庆市指导性科技计划项目(szdfy-2015-50)； “校内培育课题资助计划”(XZR2014-17)资助

孙 鹏(1982—)，男(汉族)，黑龙江人，助理研究员，从事食品质量与安全研究、样品前处理技术研发。E-mail: byndsunpeng@sina.com

高玉玲(1983—)，女(汉族)，黑龙江人，助理研究员，从事色谱分析研究。E-mail: i_am_0@163.com

时间：2017-04-13；网络出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20170413.0942.016.html

O657.63

A

1004-2997(2017)03-0342-07

10.7538/zpxb.2016.0091