基于FPLC-LC-MS/MS分析嗜盐古菌Haloarculahispanica胞内类泛素化底物

吴一飞，韦露莎，陈 辉

(1.西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119)

基于FPLC-LC-MS/MS分析嗜盐古菌Haloarculahispanica胞内类泛素化底物

吴一飞1，韦露莎2，陈 辉1

(1.西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119)

本研究结合SLIC克隆技术和快速蛋白质液相色谱-高效液相色谱-串联质谱(FPLC-LC-MS/MS)法，对嗜盐古菌Haloarculahispanica类泛素蛋白ThiS的泛素化底物和缀合位点进行鉴定分析。采用SLIC克隆法构建类泛素蛋白ThiS表达质粒/整合质粒，经转染后的菌株在DMSO呼吸作用诱导下表达并纯化His6-ThiS蛋白缀合体。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，质粒型类泛素ThiS的表达远远高于基因型菌株的表达量，而通过定点突变，将ThiS的第89号位点突变成赖氨酸K和精氨酸R，进而使用胰蛋白酶对ThiS肽段上的赖氨酸残基-双甘氨肽标签进行酶切处理，采用LC-MS/MS法鉴定其底物和底物修饰位点。鉴定得到钼喋呤合成酶MoaE，蛋氨酸亚砜还原酶MsrA和其同系物MsrB，以及Fe-S簇组装蛋白SufB等4种底物蛋白。该方法通过结合蛋白位点突变和质谱检测，能够准确、有效地检测泛素/类泛素蛋白的修饰底物及其修饰位点，为深入泛素的生物性功能研究提供了切入点。

类泛素；LC-MS/MS；SLIC克隆；嗜盐古菌；蛋白缀合

泛素(Ubiquitin, Ub)作为蛋白修饰已得到广泛的研究，其主要职能是识别并锁定目标蛋白底物，并将底物蛋白运送至蛋白酶体处进行回收[1-3]。当细胞体内泛素化底物不能被蛋白酶水解时，则会引起包括膜泡蛋白运输异常、染色质传递动力变化、DNA修复、多亚基化合物中的蛋白提取功效变化等一系列的影响[4-5]。Ub的多样性功能对于真核及原核生物而言是必不可少的，但由于真核细胞的高度进化性，多种生化通路的交叉会干扰研究者对Ub/Ubl本身的探究。因此根据Ub/Ubl蛋白的高度保守性[6]，本实验将以嗜盐古菌Haloarculahispanica的Ubl蛋白ThiS作为研究对象，通过研究ThiS化缀合作用，来解释和映射真核生物Ub相应的生物功能。

ThiS是嗜盐古菌H.hispanica中一种重要的Ubl蛋白，其泛素化过程和蛋白酶体通路是调控细胞内蛋白质水平和消除错误折叠蛋白的重要机制，它参与细胞多种生理功能调控[7]，该反应体系与真核细胞泛素～蛋白酶体通路有着高度相似性[8-9]。在H.hispanica细胞中，对ThiS及其底物的鉴定是基于其β-grasp折叠的三级结构开展的，由于ThiS具有C端双甘氨肽(diGly)基序，并以异肽键的形式缀合到目标蛋白上，进而能够与目标蛋白赖氨酸残基形成ε-氨基酸组[10-11]。与泛素化相似，整个ThiS化通路是由E1-like MoaB酶(或ELSA酶)在依赖ATP参与的情况下进行的[12]。本实验将采用蛋白标记法，对H.hispanica的Ubl蛋白ThiS进行纯化分离，在胰蛋白酶酶切处理下，采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法分析泛素化底物蛋白成分，并鉴定其泛素化位点，希望进一步为类泛素-蛋白酶体反应体系提供基础数据[13-15]。

SLIC(one-step sequence-and ligation independent cloning)克隆法作为一种简便、高效、省时的方法，被越来越多地运用在基因定点突变和基因敲除中[16]。其特点是在室温环境下将限制性酶切或者反式PCR制备的目的线性互补基因片段(≥15 bp)与载体混合，使用T4 DNA聚合酶将两者连接，可以有效避免由于碱基数巨大的质粒在反式PCR反应中所产生的错误碱基配对[17-18]。

目前在伴生蛋白或结合蛋白的结构研究中，快速蛋白质液相色谱-高效液相色谱-串联质谱(FPLC-LC-MS/MS)已逐渐成为核心的研究方法[19-20]，但其分析结果很难达到绝对稳定的状态，这与蛋白的纯化分离、仪器的差异性相关[21]。因此，在该方法的高度可靠性的前提下，拟通过增加生物学重复来提高数据的可靠性。

1 实验部分

1.1 主要材料与试剂

生化试剂(蛋白胨、蛋白酶抑制剂等)：美国Sigma-Aldrich公司产品；其他分析级有机/无机化学试剂(如二甲基亚砜、Tris等)：美国Fisher Scientific公司和Bio-Rad公司产品；Phusion和Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4多核苷酸和T4连接酶：美国New England Biolabs公司和美国Bioline公司产品；Hi-Lo DNA标准品：美国Minnesota Molecular公司产品；脱盐寡核苷酸：美国Integrated DNA Technologies公司产品；胰蛋白酶：美国Promega公司产品；牛血清蛋白标准品：美国MP biomedical公司产品；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)：美国Amersham公司产品；α-His6单克隆抗体：美国Sigma公司产品；SDP-sta：美国Applied Biosystems公司产品。

1.2 仪器与软件

3130型基因分析仪：美国Applied Biosystems公司产品；细胞破碎仪：美国 Thermo公司产品；快速蛋白液相色谱Biologic DuoFlow 10系统：美国Bio-Rad公司产品；Ni-NTAagarose和Strep-Tactin Superflow 长效亲和柱料：德国Qiagen公司产品；Eksigent nano LC Ultra液相色谱仪：美国AB sciex公司产品；X光检测仪：美国Amersham Biosciences公司产品；质谱数据使用英国Matrix Science公司的Mascot软件(2.4.0版)和美国Proteome Software公司的Scaffold软件(4.0版)处理。

1.3 供试菌株和培养基

大肠杆菌(EscherichiacoliTop10 和EscherichiacoliGM2163)，嗜盐古菌H.hispanicaY27号及其基因敲除型号和所用质粒列于表1，实验所用引物列于表2。其中E.coliTop10被用来分离新构建的质粒pCD15，E.coliGM2163被用来复制质粒pCD15及pCD63，保证质粒的甲基化处理，并且随后转化到H.hispanica细胞中。在大肠杆菌(Escherichiacoli)和古菌(Haloarculahispanica)培养实验中，分别采用LB(Luria-Bertani)固/液培养基(含氨苄霉素0.1 g/L，pH 6.8)，YPC液体培养基(pH 6.5)和ATCC974固/液培养基(含新生霉素0.1 mg/L，100 mmol/L DMSO，pH 6.8)[6]。

表1 菌株和质粒Table 1 Strains and plasmid

注：*来自本工作SLIC克隆法构建

表2 研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.4 实验方法

1.4.1 SLIC克隆法对载体的构建 本实验以H.hispanicaY27基因组为模板，通过Inv-PCR对ThiS基因进行扩增。在室温条件下，将插入片段与载体按 1∶4，使用0.4 U的T4 DNA聚合酶构建整合质粒pCD63，以提高质粒构建的高效性和准确性[16]。插入的His6-ThiS基因片段两侧都应具备一个不小于15 bp的延伸碱基序列，保持该序列与线性载体插入端的两侧同源，期间使用限制性内切酶DraIII和HindIII对载体质粒进行线性化处理，最后使用胶回收移除杂带基因。PCR产物通过基因分析仪对DNA序列进行Sanger自动化测序。

1.4.2 样品的制备 从H.hispanica菌株YW104(His6-ThiS S89K)和YW106(His6-ThiS S89R)中表达具有N端His6标签的ThiS蛋白，包括ThiS缀合的大量蛋白底物复合体，在含有0.1 g/L 氨苄西林和0.1 mg/L 新生霉素的250 mL ATCC974液体培养基中进行震荡摇床培养(200 r/min；42 ℃)。待细胞生长至平台期(OD600≈2.5)时进行离心分离(4 500 g，15 min，4 ℃)，离心过程中需加入15 mL低盐缓冲液(50 mmol/L Tris pH 7.5，2.8 mol/L NaCl)。将离心收集的细胞在高盐浓度裂解液中以每5 mL/g进行重悬(含2.8 mol/L NaCl，1%Triton X-100，1 mmol/L EDTA，5 mg/L核酸酶，0.5 g混合蛋白酶抑制剂，Tris-HCl(50 mmol/L，pH 7.4))，在French Press细胞破碎仪中以1.38×104kPa高压进行3～4次细胞破碎处理。细胞裂解液在13 000 g，25 min，4 ℃条件下高速离心。使用His6亲和柱色谱纯化分离ThiS及其缀合蛋白，不同蛋白组分进行2～4次的纯化和分装，并储存于-80 ℃，备用。使用Bradford试剂盒测定蛋白浓度：向10 μL蛋白样品中加入20 μL Bradford试剂，再加入dH2O至100 μL，可依据颜色变化情况对样品进行筛选。采用二喹啉甲酸BCA对其进行定量分析，使用96孔板，加入原浓度、稀释10倍和100倍的25 μL蛋白样品，与100 μL BCA 溶液(A∶B=50∶1)混合，在OD562nm下检测蛋白浓度值，牛血清蛋白作为蛋白标品进行对照。向蛋白样品溶液中加入5 μL 200 mmol/L DTT，在95 ℃条件下处理5 min；然后将温度降至55 ℃，处理40 min；待样品冷却至室温后，加入1 μL 1 mol/L CAA，避光条件下室温孵育1 h；最后添加20 μL 200 mmol/L DTT，室温下对样品进行45 min淬火处理，以避免蛋白样品的赖氨酸烃化；在4 ℃ dH2O中隔膜透析除盐12 h，37 ℃条件下胰蛋白酶酶切处理16 h(胰蛋白酶∶样品=1∶50，质量比)。

1.4.3 免疫印记 蛋白样品在SDS上样缓冲液(100 mmol/L Tris-Cl，含2%SDS和10%甘油，0.6 g/L溴酚蓝和2.5%β-巯基乙醇，pH 6.8)中煮10～15 min。用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和电印记转膜法(PVDF膜，0.5 μm)检测蛋白样品，每个电泳孔上样等量的蛋白样品(OD600=0.065和蛋白浓度测定BCA)。免疫印迹使用α-His6单克隆抗体、化学发光剂CDP-star和X光显影检测；蛋白定量使用蛋白胶考马斯亮蓝染色45～60 min。

1.4.4 色谱条件 色谱柱：LC Packing®C18 Pep柱(75 μm×150 mm×5 μm)；流动相：A为H2O(含0.1%甲酸和3%乙腈)，B为乙腈(含0.1%甲酸和3%H2O)；洗脱梯度：0～5 min、3%A，5～10 min、3%～10%A，10～30 min、10%～60%A；流速300 μL/min。将酶切处理的蛋白样品注入色谱柱，在3 μL/min流速下用0.1%甲酸脱盐处理5 min。

1.4.5 质谱条件 电喷雾离子源，电喷雾电压为2 200 V，质谱分辨率为60 000，质量扫描范围m/z300～2 000。在上述条件下对轨道离子阱内的蛋白样品进行扫描，其中最不活跃的10种离子被碰撞诱导解离(CID)。串联质谱的动态排除设定为60 s。所有的质谱样品使用Mascot和Scaffold软件处理，Mascot用来搜索HAH(H.hispanica基因编码)，并对所有被胰蛋白酶所酶切降解的肽段分子质量进行分析。Mascot软件设定的子离子碎片误差为0.8 u，母离子误差为15×10-6。Mascot软件对Cys的碘乙酰胺派生作用，Asn和Gln的脱酰胺作用和Met的氧化等多种修饰都做了详细记录。使用Scafold验证MS/MS处理的肽段和蛋白信息，通过Peptide Prophet软件对可能性大于95.0%的多肽进行确认， 蛋白的识别需具备可能性大于95.0%并拥有2个唯一独特肽段这两项条件。

2 结果和分析

2.1 ThiS基因的克隆、鉴定与表达载体构建

根据NCBI公布的ThiS基因序列(GI:11049545)设计的特异性引物已列于表2。上游引物ThiS FW和下游引物ThiS RV扩增ThiS基因，使用SLIC法构建表达质粒pCD12和整合质粒pCD63；以pCD12为模板对ThiS进行定向突变，得到ThiS S89K和ThiS S89R，在此过程中，使用反式PCR对ThiS基因N端添加His6标签。在载体构建过程中，分别使用KpnI和BlpI、PflMI和NheI双酶切位点。将质粒转染至E.coliTop10中，于LB培养基(AMP，100 mg/L)过夜培养，接种于5 mL液体LB培养基中生成12 h，提取质粒转染至E.coliGM2163中进行质粒的甲基化处理。参照Halohandbook[22]方法将甲基化处理的表达质粒和整合质粒转染至H.hispanicaY27菌株中，进行His6-ThiS的细胞内表达。

图1 在DMSO呼吸作用下，H.hispanica不同表现型的生长曲线比较(48 h)Fig.1 Growth curves of different types of H.hispanica with DMSO respiration in 48 h

2.2 His6-ThiS蛋白的类泛素修饰表达

为了确保质粒在添加了N端His6标签后的ThiS基因型和质粒型在DMSO呼吸作用下依然保持功能的完整性，生长曲线实验将6种菌株在相同条件的YPC培养基(100 mmol/L DMSO，pH 6.8)中培养54 h，以6 h为间隔，在OD600波长下检测菌株的生长。6种菌株分别为野生型Y27、His6-ThiS、His6-ThiS S89K、His6-ThiS S89R、His6-ThiS基因型菌株，ΔThiS基因缺陷型菌株作为对照。从图1可知，质粒与基因组表达的His6-ThiS与野生型菌株Y27的生长趋势没有明显差别，ΔThiS菌株生长受到了抑制，原因是ThiS在DMSO诱导下合成DMSO还原酶以确保菌株能够进行无氧呼吸，但ΔThiS菌株的基因缺失造成了细胞在YPC培养基中无法生长。将质粒和基因组表达的ThiS菌株在ATCC974培养基中培养48 h(4 ℃，200 r/min)并收集，通过SDS-PAGE对细胞裂解液进行蛋白分离，结果示于图2。

图2 质粒型与基因型His6-ThiS的蛋白缀合对比图Fig.2 Comparison of His6-ThiS conjugation from genome and plasmid expression

图3 His6-ThiS突变体的蛋白缀合对比图Fig.3 Comparison of His6-ThiS variant conjugation via plasmid expression

从图2可知，在DMSO呼吸作用的诱导下，质粒型ThiS的泛素化表达量比基因型高，这一差异源自植入的表达质粒中含有一个高效的rRNA P2启动子，比基因组上的天然启动子具有更好的催化能力。

His6-ThiS突变体的蛋白缀合对比示于图3。可见，野生型ThiS与ThiS S89K的蛋白表达量相似，而ThiS S89R表现出更多的富集，在28、43和100～75 kDa之间的位置均能检测到额外的缀合条带，蛋白表达量明显增加。这为后期利用LC-MS/MS法分析ThiS的蛋白缀合，选择与野生型差别较小的ThiS S89K菌株提供了较为理想的参考。

2.3 ThiS缀合底物的LC-MS/MS分析

通过3次生物学重复对ThiS化缀合位点进行测定，样品在胰蛋白酶酶切处理后进行LC-MS/MS分析，经Scaffold软件分析，可以发现ThiS的C端的甘氨酸G91以异构肽方式与多个底物蛋白的Lys残基发生缀合，由ThiS化修饰产生了114.1 Da的GlyGly指纹图谱，结果示于图4～7，具体缀合位点列于表3。其中MoaE(K153、K254、K261和K262)，SufB(K350)，MsrA(K169)和MerB(K120)的序列覆盖率分别为78%，38%，46%和62%。虽然余下大部分蛋白未经双甘氨肽修饰，但大部分蛋白都被脱酰胺化(如 SufD、硫氧还原蛋白-二氧化硫还原酶)或被氧化(如核糖-1,5-二磷酸异构酶)。

通过MS/MS分析，底物蛋白MPT和酶MoaE在ThiS化过程中被多重修饰；而底物蛋白中具有单一ThiS化修饰的蛋白包括Fe-S簇组装蛋白SufB、蛋氨酸亚砜还原酶MsrA和其同源体MsrB。虽然蛋氨酸亚砜还原酶MsrA与MsrB的主要氨基酸序列相似度不高，但具有镜像的活性位点，可以通过还原蛋氨酸亚砜(S和R差向异构)残基修复氧化蛋白，形成次磺酸中间体，生成蛋氨酸[23]。

3 结论

本研究建立了类泛素蛋白ThiS缀合底物及其底物缀合位点的FPLC-LC-MS/MS分析方法，一级质谱得到底物多肽分子离子，选取目标肽离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂，形成N端碎片b型离子系列和C端碎片y型离子系列，通过对这些碎片离子综合分析得到肽段的氨基酸序列。实验还发现，质粒表达的ThiS蛋白修饰量比基因组的表达量高，在DMSO诱导作用下可为后期的分析提供更丰富的缀合蛋白，对关键位点的氨基酸置换使得底物蛋白与ThiS分离，使双甘氨肽(114 Da)得以保留在底物蛋白的赖氨酸残基上。通过对双甘氨肽的追踪可以得到一系列底物肽的相对丰度及质荷比(m/z)，进而得到一系列关键的生物学数据。而泛素～蛋白酶体的蛋白降解通路作为最广泛的生物代谢进程，使得本方法可以得到广泛的利用，并且有望为蛋白缀合研究提供便利条件。

图4 diGly修饰的MoaE缀合位点的MS/MS图Fig.4 MS/MS spectra of MoaE ThiSylation sites modified by diGly

图5 diGly修饰的MsrA缀合位点的MS/MS图Fig.5 MS/MS spectra of MsrA ThiSylation sites modified by diGly

图6 diGly修饰的MsrB缀合位点的MS/MS图Fig.6 MS/MS spectra of MsrB ThiSylation sites modified by diGly

图7 diGly修饰的SufB缀合位点的MS/MS图Fig.7 MS/MS spectra of SufB ThiSylation sites modified by diGly

表3 质粒型His6-ThiS菌株表达纯化的LC-MS/MS分析蛋白缀合底物列表Table 3 List of His6-ThiS conjugation sites by LC-MS/MS

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Conjugation and Substrate Research of Tagged Ubiquitin-Like ProteininvivoofHaloarculahispanicabased on FPLC-LC-MS/MS

WU Yi-fei1, WEI Lu-sha2, CHEN Hui1

(1.CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China；2.CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an710119,China)

The method of one-step sequence- and ligation-independent cloning (SLIC) combined with FPLC-LC-MS/MS was adopted to find out the substrate protein which modified byHaloarculahispanica’s ubiquitin-like protein ThiSinvivo. AN-terminal His6tag has been added to the ThiS with DMSO respiration to format multiple ubiquitylation conjugations. Based on SDS-PAGE analysis, the expression level of ubiquitylaion from plasmid is much higher than genome. From site mutation, the amino acid 89 of ThiS has been mutated from Serine to Lysine/Arginine. The purified ubiquitylation conjugation protein has been split up by trypsin and the modification sites were identified by LC-MS/MS analysis of GlyGly signatures(114 Da) on lysine side-chains of tryptic peptides derived from ThiS. The results show that the conjugates substrates of ThiS include 4 target proteins: MoaE, MsrA, MsrB and Fe-S cluster assembly protein SufB. Follow-up affinity purification of selected protein targets (Fe-S and MoaE) confirmed the LC-MS/MS results. This method combining the amino acid site mutation and MS/MS analytical approach is efficient and accurate for the detection of Ub/Ubl modification substrate protein, including the substrate conjugation site. This research can provide basic knowledge for the future study of ubiquitin/ubiquitin-like protein function in eukaryote cell.

ubiquitin-like protein; LC-MS/MS; SLIC (one-step sequence- and ligation-independent cloning); archaeal; protein conjugation

2016-04-05;

2016-07-15

国家自然科学基金(31670658)资助

吴一飞(1985—)，男(汉族)，陕西人，博士研究生，森林保护学专业。E-mail: yifeiwu53@163.com

陈 辉(1961—)，男(汉族)，甘肃人，教授，从事野生动植物保护与利用和森林保护学研究。E-mail: chenhui@nwsuaf.edu.cn

O657.63

A

1004-2997(2017)03-0272-10

10.7538/zpxb.youxian.2016.0070