霉菌侵染黑毛茶的显微观察

胥伟，赵仁亮，姜依何，吴丹，朱旗

1. 湖南农业大学园艺园林学院茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128

霉菌侵染黑毛茶的显微观察

胥伟，赵仁亮，姜依何，吴丹，朱旗*

1. 湖南农业大学园艺园林学院茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128

通过苏精-伊红染色法、苯胺蓝染色法结合扫描电子显微镜，观察了人工促霉条件下霉菌侵染黑毛茶的过程。经观察发现，黑毛茶叶片内部存在空腔结构，叶肉细胞结构破坏严重，一定的温、湿度条件下，霉菌孢子在茶叶表面萌发形成菌丝，由茶叶表面破损部位进入叶片内部，经叶内空腔结构生长至叶片组织各部位。上述结果为研究霉菌侵染黑毛茶的机制提供了相关依据。

黑毛茶；霉菌；侵染；显微观察

黑茶是我国六大茶类之一。茶树鲜叶经杀青、揉捻、渥堆、干燥等工序制得黑毛茶[1]。其中渥堆是黑毛茶生产的关键工序[2]，在渥堆过程中，受湿热和微生物[3-8]的共同作用，茶叶的物质发生一系列转化，形成了黑毛茶独有的品质特征。由于原料采摘比较粗老，加工成的黑毛茶需在库房中存放1～2年才能进行精制，通过精制和拼配加工成各种黑茶成品。同时，销售后的成品黑茶，民间也有通过存放以改善其口感粗涩的习俗。但在黑毛茶仓储或成品黑茶自然存放过程中，由于环境条件的变化，特别是在南方的梅雨季节，茶叶表面极易长霉菌，轻者茶叶会有风霉味，重者会使茶叶失去饮用价值，甚至产生安全问题。为了解黑茶霉变的发生规律，以及对茶叶品质的影响，本研究人工设定环境温、湿度，以促使霉菌在黑毛茶上生长，通过染色法和扫描电镜法观察霉菌菌丝在劣变黑毛茶表面及内部的生长规律，为研究霉菌导致黑毛茶生霉劣变的发生规律提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

湖南内销黑毛茶；二甲苯、乙醇（国药控股上海生物医药有限公司）；石蜡、中性树胶（Sigma-aldrich Co. Ltd.）；PBS（7.2-7.6）、苏木素、伊红、苯胺蓝（江苏维尔生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

TS-92摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；DYY-6C恒温箱（北京市六一仪器厂）；美的微波炉，MM721AAU-PW；M199切片刀（德国徕卡显微系统有限公司）；YD-315切片机（金华市益迪医疗设备有限公司）；BMJ-A包埋机（常州市中威电子仪器有限公司）；荣事达冰箱，BCD-245F；E-201-C精密pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；BA210T显微镜（Motic (Xiamen)Electric Group Co. ,Ltd.）；DY89-1盖玻片、AY89-2载玻片（海门市远泰实验器材厂）；PYX-800Q-B人工气候箱（广东韶关科力实验仪器有限公司）；KL300 LED体式显微镜（德国徕卡显微系统有限公司）；JSM-6380LV扫描电子显微镜（日本电子株式会社(JEOL)）。

1.3 方法

称取1.0 kg黑毛茶茶样盛于白瓷盘中，置于人工气候室，并设定培养条件：温度25℃，相对湿度90%。人工培养第4天可见茶叶表面开始出现菌丝，待茶叶培养第12天时进行体式显微拍照，观察茶叶表面霉菌生长情况，待培养18天霉菌生长密集时选取有代表性的茶样进行石蜡包埋制片。

黑毛茶叶片组织形态学观察材料选用未处理黑毛茶，采用苏精-伊红染色法染色观察。石蜡包埋切片后60℃烤片1～2 h，将切片置于二甲苯中10 min，2次，之后在100%乙醇中放置10 min，然后依次在95%、85%和75%的乙醇中分别放置5 min，再用蒸馏水浸洗5 min，苏木素染5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝，伊红染3～5 min，蒸馏水冲洗，95%乙醇脱水5 min，100%乙醇脱水5 min，取出后置于二甲苯中10 min，观察切片透明度，再次置于二甲苯中10 min，中性树胶封片，显微镜观察。

霉菌侵染组织形态学观察材料选用促霉培养18 d的黑毛茶，采用苯胺蓝染色法染色观察。石蜡包埋脱水方法同苏精-伊红染色法，再用蒸馏水浸洗5 min，苯胺蓝染3 h，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，直接将片子烤干，取出后置于二甲苯中10 min，观察切片透明度，再次置于二甲苯中10 min，中性树胶封片，显微镜观察。

扫描电镜观察材料选用促霉培养18 d的黑毛茶，方法同文献[9]。

2 结果与分析

2.1 黑毛茶形态学显微观察

黑毛茶叶片维管束结构完整，木质部导管排列紧密，微管形成层及韧皮部结构清晰。叶肉细胞破坏严重，根据伊红染色深浅可区分栅栏组织和海绵组织。表皮结构破坏严重，部分表皮呈隆起状，下表皮可见气孔。叶片组织存在较多空腔状结构，负责叶片有机物质运输的筛管分子可见。部分细胞壁特异性增厚，形成石细胞。大部分细胞壁结构完整，而原生质体结构破坏严重（图1）。该部分镜检结果与何国藩等[10]关于普洱茶组织切片的研究结论相似。

2.2 霉菌侵染黑毛茶显微观察

图1 黑毛茶形态学显微观察Fig. 1 The microscopic observations of the morphological changes in raw dark tea

在25℃，相对湿度90%的培养条件下，霉菌可在茶叶表面生长，孢囊梗直立于茶叶表面，孢子囊清晰可见。依据苯胺蓝可将真菌原生质体染成蓝色的特性[11]，观察了霉菌在叶片组织内的生长状态。霉菌菌丝存在于叶片表面、内部空腔及胞间层，菌丝生长不存在特定径向性。部分切片可观察到菌丝形成侧面突起，及特异化菌丝——吸器，吸器为霉菌菌丝吸收营养的主要器官，其主要出现于本研究材料细胞原生质体浓缩聚集的部位。观察到菌丝间有接触融合，考虑存在叶片组织内有性生殖的可能（图2）。

2.3 霉菌侵染黑毛茶扫描电镜观察

霉菌菌丝交织分布于黑毛茶表面，存在状态不一。气孔结构完整，部分处于开放状态。部分菌丝细胞壁坍塌老化。孢子囊结构完整，部分孢子囊已成熟并释放孢子，孢子类型不一。霉菌菌丝通过叶面破损部位侵入叶片组织，与苯胺蓝染色观察到的霉菌菌丝在黑毛茶叶片内空腔部位生长的现象匹配。观察到霉菌菌丝跨过开放气孔却未能经其进入叶片细胞内部，考虑气孔能阻碍外来物种侵入，其机理有待于进一步研究。叶片切面显示细胞结构破坏严重，细胞显微结构无法进行观察，与染色法观察到的现象匹配（图3）。

3 讨论

通过扫描电镜图片的孢子囊及孢子形态可观察出，人工促霉条件下导致黑毛茶生霉劣变的霉菌类型主要为曲霉属（Aspergillus）真菌。本研究采用苏精-伊红染色法、苯胺蓝染色法和扫描电镜法观察了黑毛茶叶片组织学形态及在高湿条件下霉菌在生霉劣变黑毛茶表面及内部的生长规律。

图2 霉菌侵染黑毛茶显微观察Fig. 2 The microscopic observations of infection of mycete in raw dark tea

图3 霉菌侵染黑毛茶扫描电镜观察Fig. 3 The microscopic observations of infection of mycete in raw dark tea by SEM

研究发现，黑毛茶经杀青、揉捻、渥堆及干燥工序后其叶片组织形态发生改变。叶片表皮破坏严重，呈断裂及隆起状，栅栏组织及海绵组织细胞松散，原生质体浓缩成团，部分厚壁细胞、石细胞及维管束细胞形态完整。茶叶加工的揉捻工艺是使茶树叶片在揉桶及揉盘棱骨的相互作用下围绕叶脉卷紧的过程[12]。叶肉细胞受到挤压撕裂，其细胞破碎度需要达到工艺要求。因此，茶树叶片在经过干燥工序后必然表现出原生质体浓缩成团、维管束细胞形态完整及叶片组织出现空腔状的结果，这为霉菌侵染提供了基质基础。

霉菌菌丝通过叶面破损部位沿叶内空腔生长，菌丝或假根特异化形成吸器寄生于原生质体及细胞壁，茶叶表面菌丝成熟形成孢囊梗，孢囊梗顶端特异化形成孢子囊。食品吸湿曲线模型GAB理论[13-14]认为，当平衡含水率为单分子层结合在基质之上时，该部分水分结合牢固，水分不被微生物利用[15]。高湿条件下，茶叶基质亲水性物质结合空气中的自由水，当水活度升高到一定程度，微生物便可利用而促进其生长，从而导致食品生霉劣变。宏蛋白组学研究表明，微生物存在利用植物细胞壁的内切1,4-β木聚糖酶、果胶酸裂解酶、果胶酯酶、α-葡萄糖醛酸苷酶[7]等。高湿条件下，经人工培养，霉菌孢子萌发生长，通过胞外酶系为霉菌提供营养。叶片破损部位及空腔结构便成了微生物最有可能利用自由水的部位。由此，室温条件下，空气湿度是未密封包装茶叶生霉劣变的限制因子。由于研究手段和实验处理设计的限制，未能观察到霉菌菌丝在黑毛茶叶片细胞内部生长的精细结构，有待进一步研究。

[1] 齐桂年, 田鸿, 刘爱玲, 等. 四川黑茶品质化学成分的研究[J]. 茶叶科学, 2004, 24(4): 266-269.

[2] 胡燕, 齐桂年. 我国不同产地黑茶的FTIR指纹图谱分析[J]. 核农学报, 2014, 28(4): 684-691.

[3] Abe M, Takaoka N, Idemoto Y, et al. Characteristic fungi observed in the fermentation process for Puer tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 124(2): 199-203.

[4] Lyu C, Chen C, Ge F, et al. A preliminary metagenomic study of puer tea during pile fermentation [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(13): 3165-3174.

[5] Xu A, Wang Y, Wen J, et al. Fungal community associated with fermentation and storage of Fuzhuan brick-tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 146(1): 14-22.

[6] Zhao M, Xiao W, Ma Y, et al. Structure and dynamics of the bacterial communities in fermentation of the traditional Chinese post-fermented Pu-erh tea revealed by 16S rRNA gene clone library [J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2013, 29(10): 1877-1884.

[7] Zhao M, Zhang DL, Su XQ, et al. An integrated metagenomics/metaproteomics investigation of the microbial communities and enzymes in solid-state fermentation of Pu-erh tea [J]. Scientific Reports, 2015, 5:1-10.

[8] 陈栋, 李晶晶, 方祥, 等. 广东陈香茶后发酵过程中主要微生物种群和酶类活性变化的研究[J]. 茶叶科学, 2010, 30(6): 429-434.

[9] 张国良, 闫大伟, 何祖华. 水稻纹枯病菌侵染过程的细胞学特征[J]. 中国细胞生物学学报, 2010, 32(3): 451-455.

[10] 何国藩, 林月婵, 徐福祥. 广东普洱茶渥堆中细胞组织的显微变化及微生物分析[J]. 茶叶科学, 1987, 7(2): 54-57.

[11] 刘基柱, 严寒静, 高晓霞. 紫玉盘茎叶的显微结构及内生真菌的分布研究[J]. 广东药学院学报, 2009, 25(6): 579-581.

[12] 安徽农学院. 制茶学[M]. 北京: 中国农业出版社, 1999: 98-100.

[13] Botheju WS, Amarathunge KSP, Mohamed MTZ. Modeling moisture desorption isotherms and thermodynamic properties of fermented tea dhool (Camellia sinensisvar. assamica) [J]. Drying Technology, 2008, 26(10): 1294-1299.

[14] 张哲, 牛智有. 茶叶吸湿解吸平衡规律的分析[J]. 华中农业大学学报, 2012, 31(6): 787-791.

[15] 曹玉兰. 水分活性对控制食品安全和质量的稳定作用[J].食品研究与开发, 2006, 27(4): 165-166, 164.

Microscopic Observations of the Infection of Mycete in Raw Dark Tea

XU Wei, ZHAO Renliang, JIANG Yihe, WU Dan, ZHU Qi*
1. Key laboratory of Tea Science of Ministry of Education, College of Horticulture and Landscape, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China

In this study, the process of mycete infection in raw dark tea under the condition of artificial mildew was observed by a combination of hematoxylin, eosin, aniline blue staining and scanning electron microscopy analysis. It was found that there was serious structural damages in mesophyll cells of raw dark tea. Under controlled temperature and humidity conditions, mycete spores were grown into mycelium on the surface of tea, crossed the damaged parts and the cavity structures and finally reached the whole leaves. These results provided a basis for understanding relative mechanism involved in mycete infection in raw dark tea.

raw dark tea, mycete, infection, microscopic observation

TS272.5+4；Q949.32

A

1000-369X（2017）03-237-06

2017-01-29

：2017-03-05

国家自然科学基金（31571802）、湖南省教育厅重点项目（14A066）、湖南省研究生科研创新项目（CX2016B283）

胥伟，男，博士研究生，主要从事茶叶加工及功能成分化学研究。*通讯作者：1965994459@qq.com