MCPIP1和IL-17c在寻常型银屑病皮损中的表达

姚婉玉 唐秀生



·论著·

MCPIP1和IL-17c在寻常型银屑病皮损中的表达

姚婉玉 唐秀生

目的： 检测MCPIP1和IL-17c在寻常型银屑病患者皮损中的表达。方法： Real-time PCR及免疫荧光检测45例寻常型银屑病患者皮损及19例正常皮肤中MCPIP1和IL-17c mRNA及蛋白表达水平，皮尔逊相关系数分析MCPIP1和IL-17c的相关性。结果： 银屑病组MCPIP1、 IL-17c mRNA相对表达量分别为0.8497±0.0661和0.4027±0.04158，对照组中分别为0.2921±0.06135和0.2374±0.02525， 差异均有统计学意义(P<0.05)。MCPIP1和IL-17c mRNA水平具有明显相关性(P<0.05)。患者组皮损中MCPIP1和IL-17c的蛋白表达水平高于正常对照组。结论： MCPIP1和IL-17c可能共同影响寻常型银屑病的发生发展。

寻常型银屑病； MCPIP1； IL-17c

银屑病是一种多基因遗传背景下的慢性炎症介导的皮肤病。白介素-17(Interleukin-17，IL-17)家族在银屑病中的作用备受瞩目，诸多研究表明T辅助细胞17(T help cell 17，Th17)细胞及相关细胞因子IL-17在银屑病的发生发展中发挥着重要作用[1]。抗IL-17a的抗体在治疗斑块状银屑病、银屑病型关节炎中效果明显[2]。IL-17c主要由上皮细胞分泌并介导一系列抗炎、抗凋亡的基因行使发挥功能。文献报道在银屑病患者皮损中IL-17c的蛋白浓度比IL-17a的浓度高125倍左右[3]。另外，小鼠角质形成细胞特异性的高表达IL-17c能够引起一自发的银屑病皮损表型[3]。这些都提示我们IL-17c在银屑病的发生发展中有着举足轻重的作用。

单核细胞趋化蛋白-1诱导蛋白1(monocyte chemotactic protein-1 induced protein-1, MCPIP1)由ZC3H12A基因编码，又称regnase-1，是MCPIP家族中的一员，该家族成员的标志性特征是都含有一个CCCH锌指结构[4]。MCPIP1是重要的负相调控炎症因子的蛋白，这种调控主要通过识别如IL-6等炎症因子的mRNA 3’-UTR茎环结构实现[5]，研究证实：MCPIP1也可负相调控T细胞关键因子IL-2，从而参与T细胞介导的适应性免疫应答[6]。Monin等[7]提出在皮肤炎症反应中，MCPIP1能负性调控IL-17c信号转达。因此，我们采用实时定量RT-PCR及免疫荧光法，对45例寻常型银屑病患者皮损中MCPIP1和IL-17c的蛋白与mRNA的表达水平进行研究，对MCPIP1及细胞因子IL-17c的表达及两者间的相关性与其在银屑病发生发展中的作用进行初步探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 45例患者均来自2015年4月至2016年10月我院收治的寻常型银屑病患者，符合寻常型银屑病诊断标准[8]，且无肿瘤、自身免疫病、重度感染、严重肝肾功能障碍等合并症。其中男29例，女16例，年龄14～69岁，平均34.52岁；发病年龄11天～35年，平均7.3年；有家族史6例，无家族史39例；45例中28例为首发患者，未曾接受过任何治疗，有9例患者近3个月内未接受糖皮质激素、免疫抑制剂及外用药治疗。采用通用的银屑病皮损面积和严重程度评分法(PASI)对所收集的寻常型银屑病患者进行病情严重程度评分。为保证PASI评分的一致性和客观性，所有患者的PASI评分均由同一实验者来完成。45例入组患者的评分3.5～26.8，平均11.00。正常对照组19例来自本院整形及皮肤外科手术切除的正常皮肤，均无免疫系统疾病及相关家族史。其中男8例，女11例，年龄20～59岁，平均29.73岁，银屑病患者组及正常对照组在年龄、性别上差异无显著统计学意义。实验经我院伦理委员会审核批准，入选患者均已签署知情同意书。取材后，将标本分为2份，一份立即置于液氮中冷冻保存，另一份置于10%福尔马林溶液中，常规石蜡包埋。

1.2 试剂 Trizol购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒和SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseHPlus)(日本Takara公司)，MCPIP1和IL-17C的引物均购自生工，MCPIP1抗体(Abcam公司)，IL-17c抗体(Abcam公司)，驴抗兔IgG二抗，Alexa Fluor®594 conjugate(Life公司)，羊抗鼠IgG二抗，Alexa Fluor®488 conjugate(Life公司)。

1.3 实时定量PCR检测患者与对照组皮损组织中MCPIP1和IL-17c mRNA表达

1.3.1 总RNA的抽提 将储存在液氮的一部分皮肤组织(100 mg)分别加入1 mL Trizol，严格在无酶条件下手工抽提总RNA。样本于-80℃冰箱冻存。紫外分光光度法检测RNA浓度(U/μL )，计算A260/A280比值，检测RNA浓度。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。

1.3.2 逆转录反应将RNA从-80℃冰箱取出，按照试剂盒说明书分别完成以下两步：第一去除基因组DNA，第二逆转录反应：加入第一步反应所得体系10 μL，5X PrimeScript Buffer2 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，加无酶水至20 μL，混匀后瞬时离心，37℃反应15 mins，85℃ 5 sec终止反应，得到的cDNA-20℃保存备用或直接进行PCR扩增。

1.3.3 Real-time PCR(实时荧光定量PCR) 依照SYBR® Premix Ex TaqTM(日本Takara公司)试剂说明书进行实验操作。使用Light Cycler96荧光定量PCR仪，检测MCPIP1和IL-17c mRNA的表达，目的及内参GAPDH Real-time PCR上下游引物(表1)。

1.3.4 免疫荧光检测患者与对照组皮损组织中MCPIP1和IL-17c的表达 将所得标本常规进行石蜡包埋并切制成厚度为0.4 μm的连续切片。检测前进行脱蜡、梯度酒精脱水，柠檬酸高压热修复，5% BSA室温封闭1 h，按照产品说明书分别滴加1% BSA配置MCPIP1和IL-17c的一抗，4℃孵育过夜，第二天取出PBS清洗后，分别使用相对应的二抗室温孵育1 h，PBS再次洗涤三次，每次5 min，DAPI核染后，显微镜下观察荧光成像。

表1 Real-time PCR引物

1.3.5 统计学方法 用SPSS18.0 for windows统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，两组数据比较采用t检验，P<0.05为组间差异有统计学意义。采用皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)分析其相关性，P<0.05认为具有相关性。

2 结果

2.1 皮损中MCPIP1和IL-17c的转录水平及相关性分析 银屑病患者组皮损中MCPIP1 mRNA的相对表达值0.8497±0.0661，正常对照组为0.2921±0.06135，P<0.005(图1a)；银屑病患者组皮损中IL-17c mRNA相对表达量为0.4027±0.04158，正常对照组为0.2374±0.02525，P<0.005(图1b)。银屑病患者皮损中MCPIP1和IL-17A mRNA的表达值均明显高于对照组，差异均具有统计学意义。其中，通过相关性分析可知MCPIP1和IL-17A的表达密切相关，r=-0.7744，P<0.0001，有统计学意义(图2)。

2.2 皮损中MCPIP1和IL-17c蛋白的表达情况 正常对照组皮损中见少量散在分布的IL-17c荧光染色的细胞(图3a)；银屑病组皮损中的IL-17c呈荧光染色的细胞较正常对照组明显增多(图3b)。同时，银屑病患者组MCPIP1表达也较正常对照组明显增多(图4a，图4b，图5a，图5b)。

图1 MCPIP1(1a)和IL-17c(1b)在银屑病和正常对照皮损中的mRNA的表达情况。银屑病患者：N正常对照=30：19(**P<0.01) 图2 MCPIP1和IL-17c表达的相关性分析

图3 IL-17c在银屑病(3a)和正常对照(3b)皮损中的表达情况，其中绿色显示为IL-17c，蓝色为DAPI(×400)

图4 MCPIP1在银屑病(4a)和正常对照(4b)皮损中的表达情况，其中红色显示为MCPIP1，蓝色为DAPI(×400)

图5 IL-17c(5a)和MCPIP1(5b)在银屑病和正常对照皮损中的表达情况(**P<0.01)

3 讨论

本研究通过实时定量反转录PCR和免疫荧光的方法对寻常型银屑病患者皮损中MCPIP1和IL-17c的mRNA和蛋白表达水平进行检测与定量分析，与对照组相比，银屑病皮损中MCPIP1和IL-17c的表达水平明显增强。

IL-17c在银屑病的炎症浸润中发挥着重要的作用。有研究证明：银屑病小鼠模型揭示IL-17家族细胞因子参与调节银屑病的发展。同样，给咪喹莫特诱导的银屑病小鼠皮下注射IL-17c会引起皮肤内淋巴细胞募集增多[9]；在同样予以咪喹莫特处理的小鼠中，IL-17c敲除小鼠较对照鼠而言，所诱导的银屑病症状明显减轻[9]。此外，在角质形成细胞中过表达IL-17c会自发产生类似人类银屑病样皮损[3]。另有研究报道，IL-17a和IL-17c在人类银屑病皮损的表达明显增高[7]，这与本研究中实时荧光定量PCR和免疫荧光的结果一致。

全基因组关联分析确定了一系列和银屑病相关的免疫相关通路上的调节因子，据报道ZC3H12A基因上有11个单核苷酸多态性(SNP)位点，但是并没有发现这些位点和人类疾病之间的关联[10]。虽然MCPIP1在银屑病患者的皮损中表达升高已经得到证实，且与我们的结果相同，但ZC3H12A是不是IL-17的靶基因仍有待研究验证，据Monin等[7]报道皮肤炎症反应中，MCPIP1能抑制IL-17c信号传导，这也间接证明了我们的结论。

本文通过对寻常型银屑病患者皮损中MCPIP1和IL-17c的检测,发现寻常型银屑病皮损中MCPIP1和IL-17c的表达明显升高，提示MCPIP1和IL-17c的水平与银屑病的病程变化和发展有关, 可以用来协助银屑病的诊断和治疗。本研究对MCPIP1和IL-17c在银屑病患者皮损中的表达及相关性进行了初步探讨, 其对银屑病发病的影响及与其他趋化因子和细胞因子相互作用的机制,尚有待于更深入的研究。

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(收稿：2016-12-28 修回：2017-02-18)

·病例报告·

Expression of MCPIP1 and IL-17c in the lesions of the patients with psoriasis vulgaris

YAOWanyu,TANGXiusheng.

DepartmentofDermotology,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,Guangxi,China

TANGXiusheng,E-mail:tangxsh6199@126.com

Objective: To detect the expression of MCPIP1 and IL-17c in the lesions of the patients with psoriasis vulgaris. Methods: The expression levels of MCPIP1 and IL-17c mRNA and protein in the lesions of the patients with psoriasis vulgaris and the normal skin samples in 19 controls were detected by Real-time PCR and immunofluorescence technique. The association between the levels of MCPIP1 and IL-17c in the patients were assessed by Pearson correlation coefficient. Results: The level of MCPIP1 and IL-17c in the lesions was 0.8497±0.0661 and 0.4027±0.04158, which was higher than those in controls (0.2921±0.06135 and 0.2374±0.02525) with significant differences (P<0.05). There was obvious correlation between the level of MCPIP1 and IL-17c mRNA. The protein level of MCPIP1 and IL-17c in the lesions was higher than that in normal controls. Conclusion: MCPIP1 can interact with IL-17c, which influences the development of psoriasis.

psoriasis vulgaris; MCPIP1; IL-17c

右江民族医学院附属医院皮肤科，广西百色，533000

唐秀生，E-mail: tangxsh6199@126.com