GABRP基因多态性与系统性红斑狼疮发病易感性的相关性

欧运超 宋继权 裴 飒 彭玮慧



·论著·

GABRP基因多态性与系统性红斑狼疮发病易感性的相关性

欧运超 宋继权 裴 飒 彭玮慧

目的： 明确γ氨基丁酸A受体π亚基(GABRP)基因单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮(SLE)发病易感性之间的关系。方法： PCR扩增111例SLE患者和120名正常对照者外周血目的基因片段,通过二代测序对目的基因片段进行测序检测rs929763位点和rs3805455位点的多态性。结果： GABRP rs929763TT、AT基因型频率在SLE组与对照组中分别为99.1%、0.9%和95.8%、4.2%，差异无统计学意义(P>0.05)。GABRP rs3805455AG、AA、GG基因型频率在SLE组与对照组中分别为45.0%、9.9%、45.0%和45.8%、8.3%、45.0%，差异无统计学意义(P>0.05)，A、G等位基因频率在SLE组与对照组中分别为32.4%、67.5%和50.0%、50.0%，差异无统计学意义(P>0.05)。结论： GABRP 基因SNP位点rs929763和rs3805455多态性可能与SLE的发病无关。

系统性红斑狼疮； 单核苷酸基因多态性； γ氨基丁酸A受体π亚基

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)是一种多系统损害的结缔组织病，发病机制尚不完全明确，目前研究表明，遗传和环境在发病中都发挥了重要作用[1,2]。γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA) 是一种存在于哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，最近几年，关于GABA及其受体在外周非神经组织如肿瘤组织、淋巴组织等中表达，从而介导胞内信号传导对细胞的调控成为研究热点[3]。最近国外有研究报道，GABRP基因多态性与SLE发病具有相关性[4]。本文主要研究中国地区GABRP基因rs929763位点和rs3805455位点多态性与SLE的相关性，以探讨GABRP基因在系统性红斑狼疮发病机制中的作用。为其进一步研究提供参考依据。同时为中枢神经递质在结缔组织疾病领域的研究提供新的视野。

1 材料和方法

1.1 研究对象 111例SLE女性患者资料均收集于2015年6月至2016年4月武汉大学中南医院和武汉大学人民医院门诊和住院患者，平均年龄45.2岁，以1982年美国风湿病学会修订的SLE分类标准为诊断标准。正常对照组120名女性，为武汉大学中南医院体检中心健康体检者，平均年龄40.1岁，并排除SLE、干燥综合征、类风湿关节炎、皮肌炎等自身免疫病，且一、二、三级亲属无SLE患者，研究对象间均无亲缘关系。本研究已通过武汉大学中南医院伦理委员会批准，并在实施过程中遵守赫尔辛基宣言，所有病例及对照均签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂 5424台式离心机(Eppendorf公司)，S1000 Thermal Cycler PCR仪(美国BIO-RAD公司)，DYY-6C 电泳仪(北京六一仪器厂)，Tanon 1600 凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；2xTsingKe Master Mix(北京擎科新业生物技术有限公司)，GABRP等位基因序列特异性引物由武汉达邦生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 取受检者外周静脉血5 mL，标本于4℃冰箱中贮存，3天内进行DNA提取。

1.3.2 提取DNA 采用苯酚-蛋白酶K法提取外周血基因组DNA，采用紫外分光光度计测定DNA含量及浓度，A260/A280>1.8。

1.3.3 特异性PCR扩增 参照文献[4]方法扩增GABRP基因rs929763位点：上游引物5'-TCCAGGTGTCTGGAGAGAGG-3'，下游引物5' -CAGCAGGGGCTCTAATCTTG-3'，PCR扩增条件：94℃预变性3 min 后，94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸5 min。PCR扩增片段为236 bp；以及rs3805455位点：上游引物5' -GCTGGCCCTGAGTACTGAAC-3'，下游引物5' -CTCTGGCTGGATTTGGAGAG-3'， PCR扩增条件：94℃预变性3 min 后，94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸5 min。PCR扩增片段为272 bp。

1.3.4 琼脂糖凝胶电泳 PCR产物经2%琼脂糖凝胶(含溴乙啶)电泳，经紫外光透射在泳道中见明显DNA条带为阳性。

1.3.5 二代测序 将DNA样本进行上机测序(此过程由武汉达邦生物科技有限公司完成)。

1.3.6 统计学方法 采用直接计数法分别对SLE组和正常组进行等位基因和基因型频率进行统计，用SPSS 17.0软包件进行χ2检验。SLE组及正常对照组间的等位基因频率及基因型频率进行卡方检验分析，当P<0.05即有统计学差异。

2 结果

2.1 rs929763位点和rs3805455位点PCR条带琼脂糖凝胶电泳图 对GABRP基因的rs929763位点PCR扩增产物的电泳图，可见到明亮的、单一的236 bp的目的基因条带，没有非特异性扩增产物；对GABRP基因的rs3805455位点PCR扩增产物的电泳图，可见到明亮的、单一的272 bp的目的基因条带，没有非特异性扩增产物(图1)。

图1 rs929763位点(左侧箭头所示)和rs3805455位点(右侧箭头所示)PCR扩增产物的电泳图

2.2 rs929763位点和rs3805455位点的多态性与SLE的相关性分析

2.2.1 rs929763位点和rs3805455位点的Hardy-weinberg检验 根据Hardy-Weinberg定律算出各基因型的理论频数，统计学分析，SLE组、对照组两位点的P值均大于0.05，说明群体基因遗传平衡，数据来自同一孟德尔群体。

2.2.2 rs929763位点和rs3805455位点的基因型频率及等位基因频率 GABRP rs929763TT、AT基因型频率在SLE组与对照组中分别为99.1%、0.9%和95.8%、4.2%，差异无统计学意义(P>0.05)。GABRP rs3805455AG、AA基因型频率在SLE组与对照组中分别为45.0%、9.9%和45.8%、8.3%，差异无统计学意义(P>0.05)，A、G等位基因频率在SLE组与对照组中分别为32.4%、67.5%和50.0%、50.0%，差异无统计学意义(P>0.05)。具体见表1。

表1 GABRP基因多态性在SLE患者和对照组的分布

2.2.3 rs929763位点和rs3805455位点基因扩增产物测序图 为进一步验证二代测序结果的准确性，随机选择SLE组rs929763位点和rs3805455位点7个样本进行一代测序(图2、3)，测序结果提示两位点基因突变(箭头处)。

图2 rs929763位点基因扩增产物测序图

图3 rs3805455位点基因扩增产物测序图

3 讨论

系统性红斑狼疮是由多种因素所致并累及全身多脏器的系统性自身免疫病，研究表明遗传、环境、性激素代谢异常、免疫失衡在发病中起重要作用。其中遗传因素在SLE的发病中扮演重要角色，近年来，随着人类基因组计划的完成，使得SLE这一基因病在寻找易感位点成为可能。SLE易感基因的定位研究受到遗传异质性、临床表现异质性、外显率低和民族背景多样性的影响。所以基因多态性与SLE的相关性之间形成了非常复杂的网络。

γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA) 是一种存在于哺乳动物中枢神经系统的重要抑制性神经递质，其受体根据对激动剂及拮抗剂的敏感性分为三种类型：GABAA、GABAB、GABAC，其中GABAA受体是哺乳动物大脑中含量最高同时也是发挥作用最重要的受体，扮演着除神经传导功能及神经调节功能外的多种角色。迄今为止，已在哺乳动物大脑中发现至少19个GABAA受体亚单位，分别由不同的基因对其编码，不同亚基组成的受体产生不同的生理效应[5]。最近几年，γ氨基丁酸在外周组织中的调节作用成为研究热点，在肿瘤方面，美国Hildegard等[6]研究发现刺激性γ氨基丁酸B型受体信号作为异常的靶点，可以用于治疗和预防胰腺癌。在免疫方面，Bhat和Soltani等[7,8]研究者报道了GABA可从老鼠巨噬细胞、T淋巴细胞中提取，Stuckey等[9]研究者报道了GABA可从人类外周血巨噬细胞中提取。GABA与自身免疫性疾也有一定的关联，Tian等[10]在模拟类风湿性关节炎的老鼠中给予口服GABA，能够减轻其关节炎症反应，可能的机制是GABA抑制T细胞增殖，抑制抗原提成细胞的功能，减少血液中IgG2a抗体的产生，最终改善类风湿性关节炎患者的炎症反应。Nigam等[11]研究者发现给银屑病患者口服GABA类似物加巴喷丁和普瑞巴林可提高治疗效果，其可能机制是GABA抑制巨噬细胞释放TNF-α，从而减轻炎症反应。

韩国Kim等[4]研究者通过观察164例SLE患者和528名健康对照，选择GABRP基因的六个SNP位点(rs929763、rs732157、rs2303134、rs1063310、rs3805455和rs3828619)，采用高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)对DNA样本SNP位点进行分析，提示rs929763、rs732157、rs3805455和rs3828619四个位点的基因型频率在SLE组与对照组具有显著差异(P<0.0001)；rs929763、rs3805455和rs3828619三个位点的等位基因频率在SLE组与对照组具有显著差异(P=0.0005)，以上结果提示GABRP基因的上述SNP位点与SLE的发病具有相关性。作者为进一步验证性别在SLE中是否为发病的重要因素，单独统计了152例SLE女性患者的六个位点，结果提示rs929763、rs3805455和rs3828619三个位点的基因型频率在女性SLE组与女性对照组具有显著差异(P<0.0001)；采用卡方检验估算了rs929763、rs732157、rs2303134、rs1063310和rs3805455五个位点在SLE组和对照组中的单倍型频率，结果提示单倍型(TCACC)在SLE组与对照组比较具有显著差异(P=0.038)。

GABRP基因在肿瘤、中枢神经系统方面研究较多，但目前国内没有关于SLE的相关性研究，为进一步证实该位点在中国汉族人群SLE发病的相关性，本实验通过观察111例SLE患者和120名健康对照，选择两个SNP位点(rs929763和rs3805455)，采用高通量基因分型对DNA样本SNP位点进行分析，结果显示GABRP rs929763TT、AT基因型频率在SLE组与对照组中差异无统计学意义(P>0.05)。GABRP rs3805455AG、AA、GG基因型频率在SLE组与对照组中差异无统计学意义(P>0.05)，A、G等位基因频率在SLE组与对照组中差异无统计学意义(P>0.05)。故GABRP基因与SLE的发病无相关性，GABRP SNP位点rs929763和rs3805455基因多态性可能不是中国汉族人群SLE的易感基因。

本研究与已报道的检测结果不一致分析原因可能与种族、地域、实验方法等因素有关。同时本研究存在以下不足：实验组和对照组样本量选择相对较少、位点选择偏少、人种单一等。GABRP基因多态性与SLE的关系有待通过增加样本量、选择更多相关位点及扩大区域研究来综合分析。

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(收稿：2016-11-06 修回：2016-12-21)

Association between GABRP gene polymorphisms and systemic lupus erythematosus

OUYunchao,SONGJiquan,PEISa,PENGWeihui.

DepartmentofDermatology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China

SONGJiquan,E-mail:songjiq@126.com

Objective: To determine the association between the polymorphisms of the GABRP gene and systemic lupus erythematosus (SLE). Methods: The aim gene fragment extracted from the peripheral blood DNA of 111 SLE patients and 120 healthy controls was amplified by PCR. The single nucleotide polymorphism (SNP) in the GABRP gene at rs929763 and rs3805455 was detected by next generation sequencing. Results: The genotype frequencies of rs929763 TT, AT and rs3805455 AG, AA and GG in the patients were 99.1%, 0.9% and 45.0%, 9.9% and 45.0%, those in controls were 95.8%, 4.2% and 45.8%, 8.3% and 45.0% respectively. The allele frequencies of A and G in the patients were 32.4% and 67.5% and those in controls were 50.0% and 50.0%. There were no significant differences of AG, AA and GG frequencies between the patients and controls (P>0.05). Conclusion: There was no association between polymorphism of rs929763 and rs3805455 in the GABRP gene with SLE.

systemic lupus erythematosus; single nucleotide polymorphism; gamma-aminobutyric acid

湖北省自然科学基金资助项目(编号：2013CFB263)

武汉大学中南医院皮肤科，430071

宋继权，E-mail: songjiq@126.com