CD8+T细胞对白癜风患者黑素细胞的杀伤机制

马锦媛 杨钰琪 李舒丽 郭伟楠 宋 璞 安亚文 高天文 李春英



·论著·

CD8+T细胞对白癜风患者黑素细胞的杀伤机制

马锦媛 杨钰琪 李舒丽 郭伟楠 宋 璞 安亚文 高天文 李春英

目的： 明确CD8+T细胞对白癜风患者黑素细胞的杀伤机制。方法： 分选白癜风患者及正常人外周血CD8+T细胞，分别与原代黑素细胞及永生化正常黑素细胞系PIG1及永生化白癜风黑素细胞系PIG3V建立共孵育杀伤模型，采用流式细胞术检测靶细胞被杀伤情况，酶联免疫吸附法(ELISA)检测杀伤环境中IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B及穿孔素的分泌水平。结果： 白癜风患者外周血CD8+T细胞杀伤原代黑素细胞及PIG3V能力，分泌IFN-γ、颗粒酶B及穿孔素水平均高于健康对照，而杀伤PIG1能力和TNF-α水平并无显著差异；白癜风患者CD8+T细胞IFN-γ分泌水平与细胞杀伤率呈明显正相关。结论： 白癜风患者CD8+T细胞杀伤黑素细胞是白癜风发病的重要机制，且该杀伤作用可能依赖IFN-γ、颗粒酶B及穿孔素分泌水平的上调。

白癜风； CD8+T细胞； 干扰素γ； 颗粒酶B； 穿孔素

白癜风是一种常见的由黑素细胞选择性破坏导致的体表黑素减退性疾病，全球发病率近1%。目前白癜风发病机制不清，有许多病因学理论，包括黑素细胞自身破坏学说、生化学说、神经起源学说、自身免疫学说、遗传学说等[1,2]。CD8+T细胞杀伤作用被认为是白癜风发病的重要机制之一，但具体机制仍不清。本文通过测定白癜风患者CD8+T细胞对正常人表皮黑素细胞及永生化黑素细胞系杀伤作用及相关细胞因子表达量，进一步探讨CD8+T细胞诱发白癜风的相关机制。

1 材料和方法

1.1 细胞(细胞系)及组织来源 原代黑素细胞由第四军医大学西京医院泌尿外科提供，取自8～22岁健康青年男性包皮术后组织(共8例)；PIGI细胞系(人表皮永生化黑素细胞系)及PIG3V细胞系(白癜风表皮永生化黑素细胞系)由美国芝加哥大学Le Poole教授惠赠；白癜风患者血液样本取自西京皮肤医院进展期白癜风患者外周血(共8例)，对照组血液样本取自西京皮肤医院健康志愿者外周血(共8名)。

1.2 培养基、试剂及主要仪器 254培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司，人黑素细胞生长添加剂购于美国Cascade Biologics公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液购于美国Sigma公司，H2O2原液购于日本TAKARA公司，鼠抗人CD8单克隆抗体购于美国Abcam公司，PerCP-Cy5.5-抗人CD8流式抗体购于美国eBioscience公司，碘化丙啶染色液(PI)购于碧云天生物技术有限公司，人IFN-γ、TNF-α ELISA检测试剂盒购于美国RD公司，人颗粒酶B ELISA及穿孔素ELISA检测试剂盒购于美国RD公司。流式细胞分选及分析仪购于美国BD公司，酶标仪购自于美国BIO-RAD公司。

1.3 杀伤环境的建立及杀伤细胞比率检测 使用254无血清培养基配制0.75 mmol/L H2O2处理靶细胞(原代黑素细胞及PIG1、PIG3V细胞系)诱导发生抗原暴露，分别于离心管内种植靶细胞1×105个细胞/管，并分别向各组管内加入2×105个细胞/管对照组或白癜风患者通过磁珠分选出的CD8+T细胞(CD8+T细胞与原代黑素细胞、PIG1细胞及PIG3V细胞HLA分型适配)，按2∶1的细胞数比例建立CD8+T细胞与黑素细胞(原代黑素细胞、PIG1细胞及PIG3V细胞)的杀伤体系；将各组离心管进行800 rpm×5 min离心，使效应细胞与靶细胞紧密结合，37℃过夜孵育16 h，弃上清液，加入200 μL/管PBS重悬细胞，随后加入PI并调整浓度至1 μg/mL，混匀震荡，室温避光染色15 min；1 h内采用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

1.4 ELISA检测杀伤体系中IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B及穿孔素含量 按照1.3步骤建立CD8+T细胞与PIG1、PIG3V细胞杀伤体系；采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，试剂盒来源见1.2，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.5 统计软件及统计图制作 所有实验均进行了三次独立重复后统计分析，采用Graphpad Prism 5.0软件，各组间均数比较采用双向方差分析及studentt检验，用直线相关分析法处理指标间的关系，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 CD8+T细胞杀伤黑素细胞比例 白癜风患者CD8+T细胞对原代黑素细胞杀伤率均显著高于对照组，差异有统计学意义(图1a，P=0.003)。白癜风患者CD8+T细胞杀伤对PIG3V细胞比例较对照组明显升高(P=0.0411)，而在PIG1细胞中两者无明显差异(图1b，P=0.1467)；在对照组和白癜风患者组中，CD8+T细胞对PIG3V细胞的杀伤作用明显高于对PIG1的杀伤作用，差异有统计学意义(图1b，P=0.025)。

图1 a.白癜风患者及正常人群CD8+T细胞致原代黑素细胞死亡比例(n=8，**P<0.01)；b.白癜风患者及正常人群CD8+T细胞致PIG1、PIG3V细胞死亡比例(n=8，*P<0.05)

2.2 ELISA实验检测杀伤体系中IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B及穿孔素的分泌水平 白癜风患者组CD8+T细胞杀伤PIG1及PIG3V细胞时IFN-γ分泌水平较对照组明显升高(图2a，PIG1组P=0.0119、PIG3V组P=0.0101)，而TNF-α分泌水平并无明显变化(PIG1组P=0.3089、PIG3V组P=0.4498)。白癜风患者CD8+T细胞杀伤PIG1及PIG3V细胞时颗粒酶B的分泌水平较对照组显著升高(P<0.001)，但在PIG1及PIG3V细胞间无明显差异(图2b)。白癜风患者CD8+T细胞杀伤PIG1及PIG3V细胞时穿孔素分泌水平较对照组显著升高(P<0.001)，且针对PIG3V细胞分泌的穿孔素水平明显高于针对PIG1细胞的分泌水平(图2c，P=0.0015)。

图2 白癜风患者及正常人群CD8+T细胞与PIG1、PIG3V共孵育环境中IFN-γ (a，n=5，*P<0.05)、颗粒酶B(b，n=7，***P<0.001)及穿孔素(c，n=6，**P<0.01，***P<0.001)表达水平

3 讨论

CD8+T细胞在多种自身免疫相关疾病中发挥作用。有报道斑秃患者及银屑病患者外周血中CD8+T细胞数量上升[3]。近年来研究发现，CD8+T细胞介导杀伤黑素细胞是白癜风重要的发病机制之一。有研究认为白癜风患者血液及皮损中均可出现抗黑素细胞的CD8+T细胞，且数量与疾病严重程度相关。同时，白癜风患者CD8+T细胞能够杀伤无皮损部位的黑素细胞[4]，提示CD8+T细胞的杀伤作用与疾病进展密切相关。Zhang等[5]报道非节段型白癜风患者活跃期表达皮肤归巢CD8+T细胞中趋化因子受体CCR4表达水平明显升高。Byrne等[6]研究发现白癜风受累的小鼠CD8+T细胞可针对黑素细胞分化抗原TRP2反应。本研究通过流式细胞实验发现在原代黑素细胞及永生化细胞系中，白癜风患者的CD8+T细胞均可诱导黑素细胞杀伤增加，也进一步证明了上述观点。

CD8+T细胞诱发白癜风的分子机制方面，有研究认为T细胞能够通过胞内联接引导Fas配体(FasL)与靶细胞上凋亡相关的Fas分子结合，从而诱导靶细胞凋亡[7]。然而也有文献报道在白癜风患者中CD8+T细胞FasL含量并无明显上升，提示FasL可能在白癜风黑素细胞死亡中没有重要意义[8]。Lili等[9]通过实验测定白癜风患者CD3+T细胞中IFN-γ+CD8+T细胞、颗粒酶B+CD8+T细胞(GrB+CD8+T细胞)及穿孔素+CD8+T细胞(Perforin+CD8+T细胞)比例较正常人明显升高。本研究建立的杀伤环境中，白癜风患者组上清液的IFN-γ，颗粒酶B及穿孔素水平均有不同程度升高，也从另一角度证实白癜风患者表达IFN-γ、颗粒酶B及穿孔素的CD8+T细胞比例升高。同时，在白癜风患者CD8+T细胞参与的杀伤环境中，PIG3V细胞组上清中的穿孔素含量较PIG1细胞也明显升高，说明白癜风患者的黑素细胞可能存在某种机制诱导Perforin+CD8+T细胞增殖或促进CD8+T细胞表达分泌穿孔素。Zhang等[5]通过实验也认为白癜风患者表皮内可能存在某种抗原诱使CD8+T细胞增殖及归巢，且这一现象中存在CCR4的参与,但具体发生机制仍待进一步研究。

[1] 张成,唐金,刘建兰,等.单核苷酸多态性rs2236313与汉族人寻常型白癜风临床表型的相关性研究[J].中国麻风皮肤病杂志,2011,27(7):451-454.

[2] Abreu AC, Duarte GG, Miranda JY, et al. Immunological parameters associated with vitiligo treatments: a literature review based on clinical studies[J]. Autoimmune Dis,2015,2015:e196537.

[3] Yano S, Nakamura K, Okochi H, et al. Analysis of the expression of cutaneous lymphocyte-associated antigen on the peripheral blood and cutaneous lymphocyte of alopecia areata patients[J]. Acta Derm Venerol,2002,82:82-85.

[4] Harris JE, Harris TH, Weninger W, et al. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-c for autoreactive CD8+T cell accumulation in the skin[J]. J Invest Dermatol,2012,132(7):1869-1876.

[5] Zhang BX, Lin M, Qi XY, et al. Characterization of circulating CD8+T cells expressing skin homing and cytotoxic molecules in active non-segmental vitiligo[J]. Eur J Dermatol,2013,23(3):331-338.

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[9] Lili Y, Yi W, Ji Y, et al. Global activation of CD8+cytotoxic T lymphocytes correlate with an impairment in regulatory T cells in patients with generalized vitiligo[J]. Plos One,2012,7:e37513.

(收稿：2016-09-07 修回：2016-10-26)

Mechanism of CD8+T cells killing melanocytes in the patients with vitiligo

MAJinyuan,YANGYuqi,LIShuli,GUOWeinan,SONGPu,ANYawen,GAOTianwen,LIChunying.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity，Xi'an710032,China

LIChunying,E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

Objective: To determine the killing mechanism of CD8+T cells to melanocytes in the patients with vitiligo. Methods: CD8+T cells were obtained from peripheral blood in 8 patients with vitiligo and 8 healthy controls. The primary melanocyte, immortalized normal melanocyte cell line PIG1 and immortalized vitiligo melanocyte cell line PIG3V were co-cultivated with selected CD8+T cells respectively. The number of the death of melanocytes killed by CD8+T cells was assessed by Flow cytometry. The expression levels of IFN-γ, TNF-α, granzyme B and perforin were measured by ELISA. Results: The number of died primary melanocytes and PIG3V killed by CD8+T cells, the expression level of IFN-γ, granzyme B and perforin in the patients with vitiligo was higher than those in controls. There was no significant difference in the number of died PIG1 and the expression level of TNF-α between the patients and healthy controls. There was an obviously positive correlation between the level of IFN-γ secreted by CD8+T cells and the number of died melanocytes killed by CD8+T cells. Conclusion: The killing of melanocytes by CD8+T cells plays an important role in the development of vitiligo, which probably depends on the increased expression of IFN-γ, granzyme B and perforin.

vitiligo; CD8+T cells; IFN-γ; granzyme B; perforin

国家自然科学基金资助项目(编号：81502717, 81602764, XJZT15M10)

第四军医大学西京皮肤医院，陕西西安，710032

李春英，E-mail: lichying@fmmu.edu.cn