抚顺市2014年肠道病毒71型VP1区基因特征分析

李冰洁

摘要：目的 探讨抚顺市2014年手足口病（HFMD）相同来源肠道病毒71型分离株（EV71）的VP1区基因特征。方法 从2014年手足口患者20份咽拭标本中进行EV71病毒分离，随机挑取2株分离株经RT-PCR扩增VP1区，并对扩增产物进行核苷酸序列分析，构建2株分离株与各代表株间的基因亲缘性进化树。结果 在对2株EV71进行VP1区基因测定显示：与C4亚型代表株的核苷酸序列同源性较高，在亲缘进化树上，属于C4基因亚型进化分支。结论 从HFMD患者中分离出的EV71为C4基因亚型进化分支，在亲缘性进化树中为紧密相连的一小簇，呈单源进化关系。

关键词：肠道病毒EV71型；手足口病；基因特征

Analysis of Genotype of VP1 Region of Enterovirus 71 in Fushun City， 2014

LI Bing-jie

（Fushun City Health School，Fushun 113006，Liaoning，China）

Abstract：Objective To investigate the VP1 gene characteristics of enterovirus 71 isolate（EV71），the same source of HFMD in Fushun City，2014. Methods The EV71 virus was isolated from 20 swallow specimens of hand，foot and mouth in 2014.Two VP1 isolates were amplified by RT-PCR and the amplified products were analyzed by nucleotide sequence analysis.Two isolates were constructed Gene-related phylogenetic trees between the plant and the representative.Results The VP1 gene of two EV71 showed that the nucleotide sequence of C4 subtype was higher than that of C4 subtype，and belonged to C4 subtype evolutionary branch in kinship phylogenetic tree.Conclusion EV71 isolated from HFMD patients is an evolutionary branch of C4 gene subtype，and it is a small cluster closely connected in phylogenetic tree，showing a single evolutionary relationship.

Key words：Enterovirus EV71；Hand，foot and mouth disease；Genetic characteristics

腸道病毒71型（EV71）在分类上属于小RNA病毒科肠道病毒属，主要通过人群间的密切接触传播，也可经消化道传播，引起手足口病（HFMD）、类脊髓灰质炎脑炎等疾病。尤其是手足口病，由于其传染性强、传播速度快、儿童病死率较高等特征，因此备受重视[1]，被列为国家法定传染病，并且近几年也已引起社会广泛的重视。据不完全统计，在丙类传染病中，HFMD报告发病数和报告死亡数均已跃居前位。为了解抚顺市手足口病基因特征，于2014年对HFMD患儿的咽拭子标本进行鉴定及EV71病毒进行了深入分析与探讨。

1 材料与方法

1.1临床标本 采集抚顺市某医院2014年6月～9月临床诊断为HFMD的20例患儿的咽拭子标本，装入特定采集管中，-70 ℃冰箱冻存备用。

1.2病毒分离鉴定 将发病3 d内的咽拭子标本分别接种于人横纹肌肉瘤细胞和非洲绿猴肾细胞中，每份标本在两种细胞中各接种3管，每天观察细胞病变，连续培养7 d，并至少传2代，当出现细胞病变后，则使用荧光定量PCR（Real time-PCR）方法进行鉴定。

1.3病毒RNA核酸提取 取收获的病毒上清液，使用核酸提取仪，应用 Minibest Viral RNA Kit（TAKARA，Cat，No： DV818A）按照说明书进行提取病毒核酸。

1.4病毒核酸PCR荧光检测 应用肠道病毒EV71核酸试剂盒说明书进行PCR扩增，采用Real time-PCR方法检测，在PCR仪上进行荧光定量分析。

1.5 RT-PCR法扩增EV71病毒VP1区 VP1区引物序列设计参见文献[2]，用全长VP1区基因片段EV71VP1F和EV71VP1R作为引物，在此扩增引物基础上进行RT-PCR，其反应条件：50 ℃ 30 min、93 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、68 ℃ 2 min，经35个循环，72 ℃延伸10 min，转入4 ℃ 10min，预计产物大小为1015 bp，并对肠道病毒EV71的VP1区进行核酸序列测定。

1.6 EV71VP1区核苷酸序列测定和分析 用QIAquick Gel Extraction Kit[3]试剂盒进行纯化，并对测序的产物标记，在ABI-310型核苷酸自动测序分析仪上检测，所得结果用MEGA4构建进化树，采用NCBI的GenBank的数据库对比分析。

2 结果

2.1标本的核酸检测结果 对所采集的20份标本用 Real time-PCR检测方法进行肠道病毒EV71型检测，检测结果是其中9份标本的CT值小于35，可以确定为EV71阳性标本。

2.2病毒的常规分离 我们采用人横纹肌肉瘤细胞（RD）和非洲绿猴肾细胞（VERO）两种细胞做病毒分离，将所采集的9份阳性标本分别加入细胞中，每份标本在三种细胞上至少传三代，共观察21 d。其中有8份标本在VERO细胞出现了明显的CPE，出现细胞肿胀、变圆、聚集成葡萄串状的病变；5份标本在RD细胞出现了明显的CPE，出现细胞皱缩、变圆脱落的病变。通过用两种细胞进行培养，我们共分离出了8份阳性病毒液，其中有5份标本在RD和VERO细胞上都有病变，3份标本只在VERO细胞上有病变，说明对肠道病毒EV71型，VERO细胞更为敏感。

2.3分离株的RT-PCR检测 从8份阳性标本中提取病毒DNA，用EV71病毒VP1区引物进行PCR扩增。扩增条带经琼脂糖凝胶电泳显示，片段大小在1056 bp左右，条带清晰无杂带[4]，PCR扩增片段经TA克隆并进行测序。將病毒序列在GenBank中用Blastn进行比对分析，发现与C4亚型代表株具有最高的核苷酸序列及氨基酸序列的同源性，因此8株病毒为肠道病毒EV71行C4亚型。

2.4肠道病毒EV71型的进化树分析 分离株EV71型的VP1区核苷酸序列长度均为891个核苷酸，编码297个氨基酸。VP1区核苷酸分为A、B、C三个基因型[3]，其中B又可分B1 B4基因亚型、C分为C1 C4四个亚型。在GenBank中检索表明：随机选取的2株EV71分离与C4亚型代表株的核苷酸序列同源性较高，在亲缘进化树上，属于C4基因亚型进化分支，为2014年流行株的分子流行病学特征。其构建的2株分离株与各代表株间的基因亲缘性进化树（见图1）。

3 讨论

全球最早报道手足口病流行的国家为新西兰，随后陆续在其它国家和地区均有此病的报道。近年来，随着疾病的流行，我国学者对肠道病毒EV71基因型的研究也逐渐深入，如吕莉琨等人对天津地区引起的HFMD已进行了分子流行病学的研究，尤其是2008年阜阳市引起HFMD爆发疫情后，引起了社会的广泛关注，对EV71的分子流行病学研究也越来越多，而研究的重点集中在VP1区基因序列分析上，VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性[5]，可作为肠道病毒属内血清型分类依据。根据VP1核苷酸序列的差异，将EV71分为A、B、C3个基因型，B型又细分为B1～B5[6]，C型细分为C1～C5，是我国主要流行株，也是2014年抚顺市HFMD疫情的流行株。

通过构建种系进化树模型，分离得到的2株分离株与C4亚型连接为一小簇，并且与A、B基因型在遗传点位上相距较远，说明2株分离株均为C4亚型，这与吕莉琨等人的研究相似[7]，并与中国大陆目前流行的EV71的优势基因亚型一致[8]；其次，2个样本在进化树构建中密切相连，簇状排列，属于单源进化。

EV71感染是对儿童威胁性较大的病毒性疾病之一，每年都有儿童因感染EV71而死亡的报道，尽管台湾及邻近的国家均报道有多种基因型、亚型的流行，但中国大陆报道的流行株仍以C4亚型为主，病毒变异不大，由于EV71对VERO细胞敏感，VERO细胞是WHO推荐的可以用于疫苗生产的细胞，其安全性在疫苗生产中已经得到了充分的验证，这就为EV71疫苗的研制提供了基础，目前我国已经研制出了EV71疫苗，并在临床上已经加以应用，这种对儿童威胁性较大的病毒性疾病今后一定会得到有效的控制。

参考文献：

[1]刘佳，夏玛丽，黄江河，等.2013年克拉玛依市手足口病EV71型VP1基因特征分析[J].中国卫生检验杂志，2015，1（25）：238-244.

[2]龚黎明，葛琼，严菊英，等.浙江省肠道病毒71型的分离与VP1区域序列分析[J].中华流行病杂志，2005，26（12）：971-974.

[3]于伟，姚文清，陈静乙.辽宁省2008年-2009年肠道病毒71型VP1区基因特征分析[J].中国卫生检验杂志，2011，4（21）：987-992.

[4]张眉眉，于伟，孙海波，等.辽宁省首株人腺病毒14型的分离与鉴定[J].疾病监测，2014，9（29）：684-687.

[5]邵强，杨全中，冯真真，等.肠道病毒71型安徽、河南株的分离与VP1区序列进化分析[J].生物技术通报，2011，3：150-154.

[6]付建军，王海峰，马超峰，等.西安市手足口病肠道病毒71型分离株VP1区基因特征分析 [J].浙江临床医学，2014，9（16）：1363-1365.

[7]吕莉琨，李力，李佳萌，等.天津地区肠道病毒71型的分子特征分析[J].中国卫生检验杂志，2009，10（19）：2236-2239.

[8]范丽霞，巴卓玛，冀天骄，等.2012年青海省肠道病毒71型VP1区基因特征分析[J].医学动物防制，2013，4（29）：361-363.

编辑/钱洪飞