高效液相色谱/二极管阵列法快速测定白酒、配制酒与葡萄酒中5种人工合成甜味剂

包 懿，石金娥，刘 斌，王庆峰，李 宁，刘 洋

(吉林省食品检验所，吉林 长春 130103)

高效液相色谱/二极管阵列法快速测定白酒、配制酒与葡萄酒中5种人工合成甜味剂

包 懿*，石金娥，刘 斌，王庆峰，李 宁，刘 洋

(吉林省食品检验所，吉林 长春 130103)

建立了一种快速检测白酒、配制酒和葡萄酒中安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、阿力甜及纽甜5种人工合成甜味剂的高效液相色谱分析方法。采用C18柱为分离柱，对流动相的组成和洗脱方式、检测波长等参数进行优化。结果表明，以乙腈和0.02 mol/L硫酸铵(pH 4.4)溶液为流动相，梯度洗脱，柱温40 ℃，可使5种人工合成甜味剂在15 min内实现基线分离。最佳检测波长下，5种甜味剂在4～200 mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999。样品加标回收率为95.2%～103.2%，相对标准偏差(n=5)均不大于3.4%。该方法简便、快捷、准确、灵敏度较高，适用于白酒、配制酒和葡萄酒等各类酒中5种人工合成甜味剂的快速检测。

高效液相色谱/二极管阵列；人工合成甜味剂；白酒；配制酒；葡萄酒

甜味剂是一类用于改善食品风味的食品添加剂，按其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂[1-2]。人工合成甜味剂主要包括安赛蜜(Acesulfame-K，AK)、糖精钠(Saccharin Sodium，SA)、阿斯巴甜(Aspartame，ASP)、阿力甜(Alitame，ALT)及纽甜(Neotame，NTM)等，其主要特点是在人体内不进行代谢吸收、低能量或无能量,其甜度为蔗糖的数十倍至数千倍，所以常称其为非营养型甜味剂或高甜度甜味剂，是目前食品生产及加工领域广泛应用的甜味剂[3]。

随着我国人民生活水平的提高，酒的消费量呈现快速增长的趋势，酒中添加人工合成甜味剂的安全性备受消费者的关注[4]。美国、欧盟、日本等国家对人工合成甜味剂的使用限量各不相同[5]。为了保障酒的饮用安全，我国对酒中允许使用的食品添加剂的种类和限量作了明确规定，国家标准GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[6]中规定不允许安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜等人工合成甜味剂添加到各类酒中，仅允许配制酒和除葡萄酒之外的发酵酒可检出少量的糖精钠和纽甜，配制酒中糖精钠的限量为0.15 g/kg，除葡萄酒之外的发酵酒中纽甜的限量为0.033 g/kg。然而，在生产过程中非法使用、超限使用人工合成甜味剂的情况时有发生，因此建立一种简单、快速、准确的测定酒中多种人工合成甜味剂的分析方法，对于保障消费者的饮酒安全尤为重要。

针对上述人工合成甜味剂的检测，已报道的方法有离子色谱法[7]、毛细管电泳法[8-10]、气相色谱法[11]、高效液相色谱-紫外分光光度法[12]、高效液相色谱-串联质谱法[13-17]、高效液相色谱-蒸发光散射检测法[18-19]和高效液相色谱-二极管阵列检测法[20]等。由于阿斯巴甜、阿力甜和纽甜等二肽类人工合成甜味剂的分子结构复杂，不易气化，衍生难度大，不易用气相色谱法检测；安赛蜜、糖精钠属于盐类物质，易溶于水，不能直接用气相色谱法检测，需衍生化后进样，方法复杂，现基本不采用气相色谱检测安赛蜜和糖精钠；阿斯巴甜、阿力甜、安赛蜜及糖精钠在水中以阴离子形式存在，可以用阴离子交换的离子色谱进行分离检测，然而用离子色谱法检测纽甜目前尚未见报道；毛细管电泳法重现性和分离效果差的缺点限制了其在人工合成甜味剂检测领域的应用。在上述方法中，高效液相色谱法最为常用，可联接紫外分光光度检测器(UV)、质谱型检测器(MS)、蒸发光散射检测器(ELSD)及二极管阵列检测器(DAD)等多种检测器。其中，紫外分光光度检测器由于在检测过程中波长固定，只适用单一或2种甜味剂的检测；各类质谱型检测器具有分析速度快、灵敏度高、抗干扰性强等优点，但设备费用昂贵，使用环境要求及后期运行维护成本较高，不适用于基层检验实验室推广；二极管阵列检测器是一种具有极佳应用前景的新型检测器，具有操作简单、设备成本及维护成本低等优点，一次进样就能对被测物进行190～800 nm全波长立体扫描，选择被测物最佳检测波长下对其进行定量分析，可大大提高检测灵敏度。鉴于此，本研究建立了一种高效液相色谱/二极管阵列检测器同时检测酒类产品中5种人工合成甜味剂的方法，该方法样品前处理简单、分析快速、灵敏度高，适用于白酒、配制酒及葡萄酒中人工合成甜味剂的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-M20A型二极管阵列检测器(日本Shimadzu公司)；BP211D型电子天平，赛多利斯仪器有限公司；NEVA-P型氮吹浓缩仪(美国Organomation)；Allegra 64型离心机(美国Beckman公司)；KQ-300VDE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q型超纯水系统；IKA涡旋振荡器；具塞锥形瓶、移液管、量筒等玻璃器皿均为天玻玻璃仪器有限公司产品。

1.2 材料与试剂

标准品：安赛蜜、糖精钠，购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH；阿力甜、纽甜、阿斯巴甜，购于美国USP公司。试剂：甲醇、乙腈、甲酸、硫酸，均为色谱纯，购于美国Fisher公司；甲酸铵、乙酸铵、硫酸铵，均为色谱纯，购于上海阿拉丁有限公司；实验用水由Milli-Q型超纯水系统制备。白酒样品10份、配制酒样品10份、葡萄酒样品10份(均为干型)，购于超市。

1.3 实验方法

1.3.1 标准储备液及标准溶液的配制 准确称取上述标准品用水溶解并定容，配制成0.5 g/L的混合标准储备液，储存于-4 ℃冰箱中备用。准确移取标准储备液于各容量瓶中，用流动相稀释配制成质量浓度范围为4.0～200.0 mg/L的系列混合标准溶液。

1.3.2 仪器参数条件 色谱柱：Agilent XDB C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A为0.02 mol/L硫酸铵溶液(硫酸调pH值至4.4)，B为乙腈；流速：0.8 mL/min；二极管阵列检测器：190～800 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。梯度洗脱程序：0～2.0 min，95% A；2.0～8.0 min，95%～50% A；8.0～10.0 min，保持50% A；10.0～11.0 min，50%～95% A；11.0～15.0 min，保持95% A。

1.3.3 分析方法 分别取白酒、配制酒样品5 mL于50 ℃氮吹仪中除去乙醇，转移至50 mL容量瓶中，用水定容，过0.22 μm滤膜后供HPLC分析。取葡萄酒样品5 mL于10 000 r/min下离心5 min，转移至50 mL容量瓶中，用水定容，过0.22 μm滤膜后供HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

对流动相的组成进行优化，首先考察了乙酸铵-甲醇、硫酸铵-甲醇、甲酸铵-甲醇及辛烷磺酸钠-磷酸离子对试剂-甲醇等体系，发现甲酸铵-甲醇体系下分离效果较好且峰值响应高，但在低波长检测时基线漂移严重，干扰被测物的测定。考虑到甲醇的截止波长为210 nm左右，乙腈的截止波长在190 nm左右，阿斯巴甜和阿力甜的检测波长在200 nm，而且乙腈的洗脱能力强、粘度小，故选择乙腈作为流动相的有机相。考察了各缓冲盐溶液的洗脱效果，发现乙腈-硫酸铵缓冲溶液体系的效果最好，当硫酸铵缓冲溶液的浓度为0.02 mol/L，pH值为4.4时，5种人工合成甜味剂的色谱峰形和分离度达到最佳。

采用梯度洗脱的方式，起始为95%的硫酸铵缓冲溶液，2 min后逐渐降至50%，随着有机相比例的增加，洗脱能力增强，阿斯巴甜、阿力甜及纽甜的出峰时间提前，分析时间缩短。8～10 min范围内有机相的比例保持在50%，10～11 min范围内有机相的比例降至5%，直至5种被分析物完全基线分离。实验发现，在起始阶段1～2 min内，硫酸铵缓冲溶液的比例在95%～50%范围内变化对安赛蜜和糖精钠的出峰顺序和分离度影响较小，只是在出峰时间上略有差异。在2～11 min范围内，硫酸铵缓冲溶液的比例不恰当会导致阿力甜和纽甜峰形变差或者峰丢失。

图1 5种人工合成甜味剂混合标准溶液(200.0 mg/L)的液相色谱图Fig.1 Chromatogram of five artificial sweeteners (200.0 mg/L) mixed standard solution

二极管阵列检测器(DAD)在实验过程中采用全波长扫描的形式，利用被分析物的紫外光谱图，确定其最大吸收波长，并在此波长下积分计算其峰面积或峰高。本实验的测定波长分别为：安赛蜜(AK)和糖精钠(SA)230 nm，阿斯巴甜(ASP)和阿力甜(ALT)200 nm，纽甜(NTM)218 nm。实验也分别考察了柱温(25，30，35，40 ℃)对5种人工合成甜味剂分离情况的影响。结果发现，5种人工合成甜味剂的保留时间随着温度的升高而减小，但分离度降低，当柱温高于40 ℃后分离度基本无变化，故柱温设定为40 ℃。

在优化后的色谱条件下，对5种人工合成甜味剂进行分析，在15 min内实现基线分离，分离度均大于1.5，色谱图见图1。

2.2 样品处理条件的选择

白酒和配制酒的主要成分是乙醇和水，在进行实际样品分析时，高浓度的乙醇会导致被分析物在色谱柱上的保留作用减弱，使峰位前移，保留时间不稳定，为了消除白酒和配制酒中高浓度乙醇对分析结果的影响，实际样品先用氮吹仪在50 ℃下除去乙醇，然后用水定容，过0.22 μm滤膜后供HPLC分析。葡萄酒中乙醇的含量低，对结果影响不明显，可直接用水稀释，离心除去葡萄酒中少量沉淀后，过0.22 μm滤膜，待测。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性范围及检出限 基于优化后的前处理及色谱条件，考察了5种人工合成甜味剂在4～200 mg/L浓度范围的线性关系及相关系数，并在空白样品中添加低浓度的各目标化合物，以信噪比为3(S/N=3)时对应的浓度为此方法的检出限，S/N=10对应的浓度为定量下限。结果表明，5种人工合成甜味剂在4～200 mg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数不小于0.999 1，定量下限均不大于1.50 mg/kg(见表1)。方法灵敏度能满足白酒、配制酒和葡萄酒中5种人工合成甜味剂的检测要求。

表1 5种人工合成甜味剂的线性关系、检出限及定量下限Table 1 Linear relationships，limits of detection(LOD，S/N=3) and limits of quantitation (LOQ，S/N=10) of five artificial sweeteners

x:concentration of sweeteners，mg/L;y:peak area

2.3.2 回收率与精密度 向空白样品(白酒、配制酒和葡萄酒)中添加低、中、高3个浓度水平的人工合成甜味剂混合标准溶液，每个浓度平行测定5次，计算加标回收率和相对标准偏差，结果列于表2，色谱图见图2。5种人工合成甜味剂的加标回收率为95.2%～103.2%，相对标准偏差(RSD)为1.8%～3.4%，方法显示了较高的准确度及精密度。

表2 5种人工合成甜味剂的回收率及相对标准偏差(n=5)Table 2 Recoveries and RSDs of five artificial sweeteners(n=5)

图2 空白葡萄酒(A)、配制酒(B)和白酒(C)样品中添加5种人工合成甜味剂混合标准溶 液(20.0 mg/L)后的色谱图Fig.2 Chromatograms of blank white spirit(A)，mixed liquor(B) and wine samples(C) after spiking with five artificial sweeteners(20.0 mg/L) mixed standard

2.4 实际样品的检测

对吉林省市售的不同品牌的白酒、配制酒和葡萄酒各10个批次进行检测，根据保留时间、紫外光谱及峰面积进行定性定量分析。结果表明，白酒和配制酒中均未检出上述5种人工合成甜味剂，1个葡萄酒样品中检出安赛蜜(26.10 mg/kg)和糖精钠(5.62 mg/kg)。向此葡萄酒样品中添加已知浓度的安赛蜜和糖精钠标准溶液，结果发现在安赛蜜和糖精钠色谱峰附近未出现新的色谱峰，且安赛蜜和糖精钠的峰面积显著增大。通过计算，其加标回收率分别为99.2%和98.1%，表明该方法可避免错判的发生。

3 结 论

本文建立了白酒、配制酒和葡萄酒中安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜5种人工合成甜味剂的高效液相色谱/二极管阵列快速检测方法。该方法快速、准确、灵敏度高，前处理步骤简单，能够满足广大基层食品检验实验室的需要，也为我国广大中小型酒类生产企业的原料把关及成品质量控制提供了简便可靠的分析方法。此方法对其他种类食品中人工合成甜味剂的检测具有借鉴意义，有望在保障食品安全的过程中发挥重要作用。

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Rapid Determination of Five Artificial Sweeteners in White Spirit，Mixed Liquor and Wine by High Performance Liquid Chromatography/Diode Array Detector

BAO Yi*， SHI Jin-e， LIU Bin， WANG Qing-feng， LI Ning， LIU Yang

(Jilin Institute for Food Control，Changchun 130103，China)

A high performance liquid chromatographic(HPLC) method was developed for the rapid determination of five synthetic sweeteners，including acesulfame-K(AK)，saccharin sodium(SA)，aspartame(ASP)，alitame(ALT) and neotame(NTM) in white spirit，mixed liquor and wine.The HPLC separation was carried out on a C18column.Several parameters，including the composition and gradient elution program of the mobile phase，column temperature and optimum detection wavelength of diode-array detector(DAD) were optimized for improving the chromatographic performance and the sensitivity of determination.The results demonstrated that the separation could be completed within 15 min by gradient elution with acetonitrile and 0.02 mol/L ammonium sulfate solution(pH 4.4) as mobile phase.The column temperature was set at 40 ℃.The calibration curves of five synthetic sweeteners were linear in the range of 4-200 mg/L with correlation coefficients more than 0.999.The recoveries were in the range of 95.2%-103.2%，with relative standard deviations(n=5) not more than 3.4%.The experimental results indicated that the established method was simple，efficient and sensitive，and was suitable for the determination of five synthetic sweeteners in white spirit，mixed liquor and wine.

HPLC/DAD;artificial sweeteners;white spirit;mixed liquor;wine

2016-11-29；

2017-01-05

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.017

O657.72;TS202.3

A

1004-4957(2017)05-0674-05

*通讯作者：包 懿，博士，工程师，研究方向：食品及相关产品检测，Tel:0431-88675932，E-mail:baoyi81@126.com