气相色谱-串联质谱法快速测定鸡肉组织中氯羟吡啶残留量

陈树兵，刘忠义，李露青，周虹玲，李 双，3

(1.宁波出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，浙江 宁波 315012；2.宁波中盛产品检测有限公司，浙江 宁波 315012；3.宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211)

实验技术

气相色谱-串联质谱法快速测定鸡肉组织中氯羟吡啶残留量

陈树兵1*，刘忠义2，李露青2，周虹玲2，李 双2，3

(1.宁波出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，浙江 宁波 315012；2.宁波中盛产品检测有限公司，浙江 宁波 315012；3.宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211)

采用气相色谱-串联质谱法快速测定鸡肉组织中的氯羟吡啶残留，样品经乙腈-水提取，冷冻脱脂后，直接以丙酸酐衍生，采用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS) 进行分析，多反应监测(MRM) 模式检测。结果表明，氯羟吡啶在 0.5～40 ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系，方法的定量下限为5.0 μg/kg，回收率为101.5%～111.8%，相对标准偏差(RSD) 小于7.7%。该方法简便、快速、灵敏度高，重现性好，可用于鸡肉组织中氯羟吡啶的快速确证检测。

氯羟吡啶；气相色谱-串联质谱；鸡肉

氯羟吡啶(Clopidol)属吡啶类化合物，因其对球虫病具有较强的抑制作用，而在畜禽养殖业中被广泛应用[1-9]。研究表明，在畜禽养殖过程中贸然停用该类药物，往往会导致球虫病爆发，而连续或过量的用药则会造成氯羟吡啶在动物体内的残留，并会随着食物链进行蓄积和传递[1,6]。氯羟吡啶具有致畸性，对人类的健康构成了极大的威胁。随着人们对食品安全的日益重视，禽肉产品中药物残留的限量要求也日益严格。欧盟以及美国、日本、中国均已规定并不断修订各种动物组织中氯羟吡啶残留的最高限量标准。美国、加拿大、日本和中国规定禽肉组织中氯羟吡啶的残留限量为5 μg/kg[7-8]。

国内外关于氯羟吡啶残留量的检测方法逐渐从难以满足当前国内外法规限量要求的、灵敏度低的气相色谱法、液相色谱法[9-11]，发展到抗干扰能力强、灵敏度高的液相色谱-串联质谱法和气相色谱-串联质谱法[1-6,8-9 ]。该类方法能够通过碰撞能量产生二级碎片离子，更好地避免了假阳性样品的出现，使检测结果更可靠。现有报道采用气相色谱-质谱(GC-MS)测定动物组织中的氯羟吡啶时，虽然可以通过衍生化反应增加衍生产物在色谱柱上的保留时间，但存在前处理过程复杂、检测效率低等问题。如陈迪等[7-8]采用甲醇提取鸡肉中氯羟吡啶，需经中性氧化铝柱净化、氮吹浓缩后，再用丙酸酐衍生。现行国家标准《GB 9699—2013鸡肌肉组织中氯羟吡啶残留量的测定 气相色谱-质谱法》同样需碱性氧化铝柱净化、氮吹浓缩，然后再用N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷进行衍生化处理[12]。

气相色谱-三重四极杆质谱联用仪(GC-MS/MS)的多反应监测方式(MRM)不受共流出物的影响，特征母离子和子离子的一一对应性使其具有极强的抗干扰能力，可有效去除其他碎片离子的干扰，提高检测灵敏度和检测通量，解决了GC-MS选择离子扫描模式(SIM)下存在的离子信息少、灵敏度不高、定性不准及检测通量较低的问题，大幅提高了对残留分析，特别是复杂基质中残留物分析的准确性和检测能力。

本研究中样品采用乙腈-水提取后经冷冻除脂，无需浓缩和固相萃取处理，直接以丙酸酐衍生，结合GC-MS/MS快速检测鸡肉中的氯羟吡啶残留量。与采用固相萃取净化的方法相比，本方法更加简单、快速、灵敏，可以满足禽类产品中该类药物残留的高通量快速检测和确证的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱-串联质谱仪:Agilent 7890/7000C(配EI源,美国安捷伦公司)。DB-5MS色谱柱( 30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国安捷伦公司)。涡旋混合器(韩国 VisionScientific 公司)。分析天平(德国 Sartorius ME 公司,0.1 mg和0.01 g)。Sigma 33K高速冷冻离心机(美国Sigma公司)。Milli-Q 高纯水发生器(美国Millipore 公司)。

乙腈、正己烷(色谱纯，德国 Merck 公司)。丙酸酐(纯度≥98%)、吡啶(分析纯)、四硼酸钠(分析纯)均为国药集团化学试剂有限公司产品。氯羟吡啶标准品(纯度≥98%,Dr.Ehrenstorfer公司)。

1.2 标准储备液与工作溶液的配制

准确称取10 mg(精确至0.1 mg) 氯羟吡啶标准品，用乙腈-水(3∶2) 溶解并定容至10.0 mL，配成标准储备液，避光于-20 ℃保存。准确吸取适量标准储备液，用乙腈定容，配成10 mg/L标准中间工作液，置于4 ℃冰箱保存。

分别准确移取一定体积的氯羟吡啶标准中间工作液，使氯羟吡啶的质量为7.5，15.0，30.0，75，150，300，600 ng，添加至称样后的空白样品中，按本方法进行样品前处理和衍生后，制得浓度为 0.5，1.0,2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 ng/mL的系列基质匹配标准溶液。

1.3 实验步骤

称取5 g试样(精确至0.1 g)于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈-水(3∶2)提取溶液，涡旋混匀后定容至15 mL，超声5 min，4 500 r/min离心5 min，取10 mL上清液于15 mL离心管中，将离心管置于-20 ℃冰箱冷冻15 min，于4 ℃以下15 000 r/min离心5 min，取上清液待衍生。

移取0.50 mL上清液，依次加入4 mL 0.1 mol/L四硼酸钠溶液、0.50 mL正己烷、25 μL吡啶和50 μL丙酸酐；涡旋混合1 min，4 500 r/min离心5 min，将上层正己烷移入进样小瓶中，供气相色谱-串联质谱测定。

1.4 GC-MS/MS测定

1.4.1 色谱条件 色谱柱：毛细管柱DB-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；进样口温度:250 ℃；升温程序：40 ℃保持1 min，以 30 ℃/min 升温至130 ℃，再以8 ℃/min 升温至300 ℃，保持10 min；载气：高纯氦气，纯度≥99.999%，流速为 1.0 mL/min；进样方式：不分流进样；进样体积为1 μL。

1.4.2 质谱条件 电离方式为 EI，电离能量 70 eV；离子源温度300 ℃；传输线温度280 ℃；采用多反应监测(MRM) 正离子模式检测，监测离子对(母离子/子离子)：定量离子对m/z为191.0/156.09，定性离子对m/z为191.0/128.0；定量离子对和定性离子对的碰撞能量均为15 eV。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的优化

提取鸡肉组织中的氯羟吡啶多采用乙腈作为提取溶剂[1-4,6,9]。实验中发现，提取溶液仅采用乙腈时，样品容易结团，不利于提取；而提取溶剂中有水存在时可以有效分散样品组织。为有效地提取鸡肉组织中残留的氯羟吡啶，分别比较了不同水相比例的乙腈溶剂的提取效果，包括0%，5%，10%，20%，30%，40%和50%水相组成。结果表明,水相比例在10%～40%时的提取效率较高且相近，但提取溶剂的乙腈比例较高时，提取液中脂肪等杂质的含量相对较高，不利于仪器和色谱柱的保护。因此，本实验最终采用含有40%水相比例的乙腈作为提取溶剂。

2.2 净化方法的选择

经乙腈-水(3∶2)提取后的鸡肉样品中含有大量抑制离子化的油脂。已报道的净化方法主要采用固相萃取法[1，6，8-9 ]，如氧化铝柱、硅胶柱等。陈迪等[7-8]采用自装填氧化铝层析柱(≥15 g)净化提取试液，回收率满足实验要求，但柱子的填充和整个净化过程繁琐耗时。因此，本文采用低温冷冻除脂，既能有效地去除提取液中的油脂，又大大提高了实验效率。实验分别比较了不同冷冻处理时间(5，10，15，20，25，30 min)下的回收率。结果发现，冷冻时间在15～30 min时的提取回收率相近，考虑到提高实验效率和节约时间成本，本实验最终采用低温冷冻15 min完成除脂。

图1 氯羟吡啶丙酯的色谱图及子离子扫描质谱图Fig.1 Chromatogram and mass spectra of clopidol propyl

2.3 MRM条件的优化

文献表明氯羟吡啶衍生物氯羟吡啶丙酯的母离子m/z为 191，其特征碎片离子包括：失去1个Cl离子后的碎裂片段m/z156，以及开环后失去乙烯分子的碎裂片段m/z128[8]。碰撞能量为 15 eV时响应值最高，故以此条件采用 MRM 模式对氯羟吡啶丙酯进行定性和定量分析。子离子扫描质谱图见图1。

2.4 基质效应

精密量取氯羟吡啶标准工作液，使氯羟吡啶的质量为0.2，0.4，1.0，2.0，5.0 ng，氮气吹干后，加入0.5 mL乙腈，按照“1.3”部分进行衍生化处理，制得浓度分别为0.4，0.8，2.0，4.0，10.0 ng/mL 的系列标准溶液。精密量取氯羟吡啶标准工作液，使氯羟吡啶的质量为0.2，0.4，1.0，2.0，5.0 ng，氮气吹干后，加入0.5 mL经“1.3”方法处理过的鸡肉空白基质溶液，按照“1.3”进行衍生化处理，制得浓度为 0.4，0.8，2.0，4.0，10.0 ng/mL 的系列基质匹配标准溶液。在相同的仪器条件下检测，以前者的信号值为基准，得到基质匹配标准溶液的相对信号值。试验中发现，其信号值的比值均低于80%，说明鸡肉样品基质对离子化有明显的抑制作用。因此，本方法采用基质加标作工作曲线，样品的提取和净化程序能保证鸡肉组织中目标物质氯羟吡啶稳定的提取效率，同时也能消除基质效应的影响，以保证测定结果的准确性。

图2 鸡肉样品的GC-MS/MS色谱图Fig.2 GC-MS/MS chromatograms of chicken samplesa:blank sample；b:blank sample spiked at 5.0 μg/kg

2.5 方法的线性范围、定量下限、回收率及精密度

分别进样测定浓度为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 ng/mL的系列基质匹配标准溶液，以氯羟吡啶衍生物的响应值为纵坐标，对应浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，氯羟吡啶在0.5～40.0 ng/mL范围内具有良好的线性关系(r2=0.999 4)，其回归方程为Y=79.07X+0.44。

用空白基质加标方法进行回收率和精密度实验。对鸡肉样品分别进行5.0，10，20 μg/kg 3个水平的加标回收实验，每个浓度水平平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差。结果表明，3个添加水平的平均回收率为101.5%～111.8%，相对标准偏差为4.2%～7.7%。本方法有较好的准确度和精密度，以实际最低加标浓度5.0 μg/kg作为定量下限，能够满足动物组织中氯羟吡啶残留监控的定量分析要求。鸡肉样品空白基质和5.0 μg/kg 水平加标的图谱见图2。

3 结 论

本文建立了气相色谱-串联质谱快速测定鸡肉组织中氯羟吡啶残留量的方法，无需浓缩和固相萃取处理，更加简单、快速，且方法灵敏度高，可以满足日常进出口禽类产品中该类药物残留的高通量快速检测和确证的要求。

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Determination of Clopidol Residues in Chicken Muscle by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Shu-bing1*,LIU Zhong-yi2,LI Lu-qing2，ZHOU Hong-ling2,LI Shuang2,3

(1.Technical Center of Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Ningbo 315012,China；2.Ningbo Zhongsheng Product Testing Company，Ningbo 315012,China；3.School of Marine Sciences, Ningbo University，Ningbo 315211,China)

A rapid method was established for the determination of clopidol in chicken by gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS).Samples were extracted with acetonitrile-water.The extract was frozen to remove the lipid within,and derivated with propionic anhydride.Then,it was analyzed by GC-MS/MS under MRM mode.The calibration curve for clopidol was linear in the concentration range of 0.5-40 ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 4.The limit of quantitation for this method was 5.0 μg/kg.The average recoveries at spiked concentrations of 5.0,10,20 μg/kg ranged from 101.5% to 111.8%,with relative standard deviations less than 7.7%.The method is simple,quick and high sensitive,and could be applied to detect clopidol residues in real samples.

clopidol；gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)；chicken

2016-12-12；

2017-01-20

国家质检总局科研计划项目(2016IK169)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.020

O657.71；TQ460.72

A

1004-4957(2017)05-0689-04

*通讯作者：陈树兵，硕士，高级工程师，研究方向：食品农产品中污染物分析，Tel：0574-87022808,E-mail:shubingchen@126.com