鸭肉中环丙沙星残留的表面增强拉曼光谱测定

赵进辉，李 耀，袁海超，刘木华

(江西农业大学 工学院 生物光电及应用重点实验室，江西 南昌 330045)

鸭肉中环丙沙星残留的表面增强拉曼光谱测定

赵进辉，李 耀，袁海超，刘木华*

(江西农业大学 工学院 生物光电及应用重点实验室，江西 南昌 330045)

为实现鸭肉中环丙沙星(CIP)残留的快速检测，建立了一种鸭肉中CIP残留的表面增强拉曼光谱(SERS)快速检测方法。进行了增强基底的紫外-可见吸收光谱分析和鸭肉中CIP残留检测的SERS可行性分析。通过单因素实验，确定了金胶加入量、含CIP的鸭肉提取液加入量、氯化钠溶液加入量和吸附时间。在最佳实验条件下，建立了鸭肉中CIP残留的SERS检测的标准工作曲线，决定系数(R2)为0.987 9，预测样本中CIP的平均回收率为97.0% ～111.7%。实验结果表明，鸭肉中CIP残留的SERS快速检测方法是可行的。

环丙沙星；表面增强拉曼光谱；鸭肉；检测

环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)是一种第三代喹诺酮类广谱抗生素，因具有较好的杀菌效果，在禽养殖业中被广泛使用。但由于对其的不合理使用，常造成禽肉中CIP残留超标，可能会对人体产生一定的毒副作用(如胸闷、头晕、肾脏损伤等)。目前用于CIP残留的检测方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、电化学法和液相色谱-质谱联用法等[1-5]，但是这些方法不能满足鸭肉中CIP残留的快速检测要求。因此，寻找一种鸭肉中CIP残留的快速检测方法是目前亟待解决的问题。

近年来，表面增强拉曼光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)作为一种具有高灵敏性的快速检测方法已用于兽药残留检测[6]。马海宽等[7-8]对鱼肉中的磺胺甲基嘧啶与磺胺二甲基嘧啶进行了SERS检测与分析。Zhao等分别对鸭肉中的螺旋霉素[9]和四环素[10]残留进行了SERS检测分析。Ji等[11]应用SERS技术检测了猪肉、牛肉、鸡等食品中的氯霉素残留。Han等[12]对自来水、湖水和土壤等样本中甲硝唑和罗硝唑进行了SERS检测分析。但尚未见基于SERS技术的鸭肉中CIP的残留检测报道。本研究以金纳米颗粒作为增强试剂，建立了一种鸭肉中CIP残留的SERS快速检测方法。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

实验用麻鸭购于江西农业大学菜市场；CIP标准品(纯度约为99.0%)购于南昌精科科学仪器有限公司；氯金酸(HAuCl4·3H2O，M=393.83，其中金含量为≥49.0%，Sigma-Aldrich公司)；乙酸乙酯、柠檬酸三钠(分析纯，汕头西陇化工股份有限公司)；氯化钠、无水硫酸钠为分析纯(天津市永大化学试剂有限公司)；实验用水为自制超纯水。

1.2 仪器设备

QE65000便携式拉曼光谱仪(海洋光学有限公司)；T10型实验室超纯水机(湖南科尔顿水务有限公司；DL-1电子万用炉(北京市永光明医疗仪器有限公司)；JJ-2B型组织捣碎匀浆机(江苏省金坛市金南仪器厂)；JK-50B 型超声波清洗器(合肥金尼克机械有限公司)；FA1004B型电子天平(精度为0.1 mg，上海上平仪器有限公司)；HSC-24B型氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；VORTEX-5旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器有限公司)；JW-1024低速离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器责任有限公司)；石英进样瓶(北京成腾器材有限公司)；石英比色皿(1 cm光程)。

1.3 实验方法

采用柠檬酸三钠还原法制备金胶纳米粒子[13]。将2 mL 1%的氯金酸加至500 mL烧杯中，用水定容至200 mL，用电子万用炉将其加热至沸腾，加1 mL 1%的柠檬酸三钠。继续加热约8 min直至溶液颜色变紫红色后，冷却至室温，4 ℃保存。

将5 g 捣碎的鸭肉和6.5 g无水硫酸钠加至50 mL离心管中，然后加入15 mL乙酸乙酯并涡旋1 min，超声振荡10 min，离心(3 000 r/min) 5 min，取上清液。重复提取1次，合并2次提取液，将其用氮气吹干后加入与氮吹前等量的水，再用快速滤纸过滤得到鸭肉提取液。称取5 mg的CIP标准品溶于一定体积的鸭肉提取液中，超声溶解定容后得到含100 mg/L CIP的鸭肉提取液加标样本，然后用鸭肉提取液将其稀释，得到含不同浓度CIP的鸭肉提取液加标样本。

将10 mg CIP标准品超声溶解于100 mL水中，得到100 mg/L的CIP标准储备液，然后将其用水稀释得不同浓度的CIP标准品溶液。

称取0.528 g的氯化钠溶于100 mL水中，得到0.1 mol/L的氯化钠溶液。

向2 mL的石英进样瓶中依次加入金胶500 μL、含不同浓度CIP的鸭肉提取液加标样本15 μL和氯化钠溶液120 μL，混合均匀后放入样品池中进行SERS光谱采集。其中，拉曼光谱仪的参数设置为：光谱仪激光功率500 mW，激光波长785 nm，积分时间10 s，积分平均2次，并选择波段为400～1 800 cm-1的SERS光谱进行研究。

通过单因素分析，优化如下4个实验条件：金胶加入量，含CIP的鸭肉提取液加入量，氯化钠溶液加入量和吸附时间。于最佳实验条件下，分别采集不同浓度的CIP标准品溶液和含不同浓度CIP的鸭肉提取液加标溶液的SERS光谱。上述所有样本的光谱均采集3次，取3次测量的平均值进行数据分析。在鸭肉中CIP残留的标准工作曲线建立与预测前，先用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法扣除荧光等背景信号。

2 结果与讨论

2.1 增强基底的紫外-可见吸收光谱

将500 μL自制金胶加1 mL水稀释，得到如图1a所示的紫外-可见吸收光谱，从曲线a可知，本研究自制金胶的最大吸收峰约在542 nm处，半峰宽约为84 nm。将500 μL金胶、15 μL鸭肉提取液加标样本与120 μL氯化钠溶液混合，再加入1 mL超纯水稀释，采集得到的紫外-可见吸收光谱如图1b所示，由图可见，金胶和CIP分子吸附后，引起了金纳米溶胶的粒径发生变化，相比曲线a，其最大吸收峰发生8 nm红移，峰形变得更宽。这可能是因为CIP分子吸附金胶粒子后，改变了金胶纳米粒子表面的等离子共振而引起的[14]。

图1 紫外-可见吸收光谱图Fig.1 UV-visible absorption spectra a.gold colloid；b.gold colloid + duck meat extract containing CIP(5 mg/L)+NaCl

图2 不同溶液的SERS光谱Fig.2 SERS spectra of different solutions a.duck meat extract；b.ultrapure water；c.conventional Raman spectrum of duck meat extract containing CIP (5 mg/L)；d.CIP solution(5 mg/L)；e.duck meat extract containing CIP(5 mg/L)

2.2 鸭肉中CIP残留检测的SERS可行性分析

分别采集鸭肉提取液样本、水、CIP标准品溶液和含CIP的鸭肉提取液样本的SERS，以及含CIP的鸭肉提取液样本的普通拉曼光谱，并将所得数据绘制成如图2所示的曲线。由曲线b可知，水的SERS光谱基本未呈现明显的峰强；对比CIP标准品溶液的SERS数据(曲线d)，可以看出CIP标准品溶液在位于1 142，1 195，1 262，1 331，1 390 cm-1处均出现较明显且突出的SERS峰，且1 262 cm-1处的SERS峰强度最大，可考虑将此处SERS峰作为检测CIP的参考特征峰。比较光谱曲线d和e可知，在含CIP的鸭肉提取液样本的SERS曲线中，1 142，1 195，1 262，1 331，1 390 cm-1处得到与曲线d类似的谱峰，而对比鸭肉提取液样本的SERS数据，曲线a在这些位置未出现SERS峰，进一步验证了以1 262 cm-1处所得拉曼峰作为检测鸭肉中CIP的特征峰是可靠的。考察自制金胶的增强效果，比较曲线c和e可以看出，未加基底所得含CIP的鸭肉提取液样本的拉曼光谱基本为一条平滑曲线；在加入金胶和氯化钠后测得的拉曼光谱曲线e上所得峰值明显增多，且特征峰的峰强也有较大增强，说明了金胶基底对拉曼光谱的增强作用。

2.3 金胶加入量对SERS信号的影响

以金胶作为SERS光谱的增强基底，金胶的加入量直接影响鸭肉中CIP的SERS增强效果。本研究分别以不同加入量的金胶(200，300，500，700，900 μL)与15 μL鸭肉提取液加标样本(5 mg/L)和120 μL氯化钠溶液混合，采集这些样本的SERS光谱数据，考察不同的金胶加入量对特征峰1 262 cm-1处SERS信号强度的影响。结果显示，1 262 cm-1处SERS信号强度随金胶加入量的增加呈先增强后减弱的趋势，在金胶加入量为500 μL时SERS特征峰的峰强最强，获得较佳的SERS信号强度。因此，确定金胶的加入量为500 μL。

2.4 含CIP的鸭肉提取液加入量对SERS信号的影响

含CIP的鸭肉提取液的加入量会影响鸭肉提取液中CIP 的SERS特征峰强度。本研究在500 μL金胶中，分别加入5，10，15，20，30 μL含CIP的鸭肉提取液(CIP浓度5 mg/L)和120 μL氯化钠溶液，混合后采集SERS光谱。结果显示，1 262 cm-1处SERS信号强度随含CIP的鸭肉提取液加入量的增加呈先增强后减弱的趋势，其加入量为15 μL时特征峰的峰强最大。此外，含CIP的鸭肉提取液加入量不同时，所得特征峰的峰强最大差值超过10 000 a.u.，很好地说明特征峰峰值受到含CIP的鸭肉提取液加入量的影响很大。因此确定实验中含CIP的鸭肉提取液最佳加入量为15 μL。

2.5 氯化钠溶液加入量对SERS信号的影响

氯化钠的加入量会影响金胶纳米粒子的凝聚程度，在SERS光谱中起活化和诱导作用，会对SERS信号的增强产生一定的影响。本实验以500 μL自制金胶作为增强基底，选取15 μL含5 mg/L CIP 的鸭肉提取液加标样本，再分别加入50，70，100，120，150 μL的氯化钠溶液，采集其各自的SERS光谱。实验结果显示，氯化钠溶液加入量为120 μL时，1 262 cm-1处特征峰的峰强达到最高。继续增大氯化钠溶液加入量时，过量的氯化钠分子可能会引发金胶纳米粒子的团聚，使得特征峰峰强降低。由此确定氯化钠溶液的加入量为120 μL。

2.6 吸附时间对SERS信号的影响

吸附时间的长短直接影响到鸭肉提取液中CIP分子在金纳米颗粒活性表面的数量，进而影响到鸭肉提取液中CIP的SERS特征峰强度[9-10]。本研究在金胶、待测液和氯化钠最佳加入量条件下考察了吸附时间的影响。结果显示，在1 min反应时间后，随着时间的增长，1 262 cm-1处的拉曼峰强度逐步变小。表明在1 min时1 262 cm-1处的拉曼峰强度最强，由此说明鸭肉提取液中CIP分子在与金胶反应1 min时可达到较佳的活性热点，此时的光谱增强效果较佳。在1 min后，金胶纳米粒子与待测液的分子可能出现了聚沉现象，使得1 262 cm-1处拉曼峰强度降低。由此确定最佳吸附时间为1 min。

2.7 鸭肉中CIP检测的SERS定量分析

采集CIP浓度在0.2～7.0 mg/L范围内的鸭肉提取液加标样本的SERS信号，根据特征峰1 262 cm-1处测得的峰强，分析了鸭肉提取液中CIP浓度与1 262 cm-1处特征峰强度之间的关系，并以鸭肉提取液中CIP的浓度(x，mg/L)为横坐标，特征峰处测得的SERS强度(y)为纵坐标绘制工作曲线，得回归方程为y=2 589.3x-894.39，决定系数(R2)为0.987 9。表明鸭肉提取液中的CIP浓度在0.2～7.0 mg/L范围内与1 262 cm-1处峰强呈良好的线性关系。

为了考察SERS技术检测鸭肉提取液中CIP残留量的可靠性，利用所得标准工作曲线方程，对CIP浓度为1.5，3.0，4.0，4.5，6.0 mg/L的样本进行预测。根据回收率实验结果，得到预测样本中CIP的平均回收率分别为99.1%，111.7%，97.0%，97.8%，98.6%，说明采用该方法检测鸭肉中CIP残留量准确有效，有利于实现鸭肉中CIP残留的快速检测。

3 结 论

本研究进行了增强基底的紫外-可见吸收光谱分析以及鸭肉中CIP残留检测的SERS可行性分析，为鸭肉中CIP残留的SERS检测提供了依据。通过单因素分析，确定了金胶加入量、含CIP的鸭肉提取液加入量、氯化钠溶液加入量及最佳吸附时间。在最佳实验条件下建立了鸭肉中CIP残留的SERS检测的标准工作曲线，得到R2为0.987 9，预测样本中CIP的平均回收率为97.0%～111.7%。

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Detection of Ciprofloxacin Residues in Duck Meat Using Surface Enhanced Raman Spectroscopy

ZHAO Jin-hui，LI Yao，YUAN Hai-chao，LIU Mu-hua*

(Optics-Electrics Application of Biomaterials Lab，College of Engineering,Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China)

A rapid detection method of surface enhanced Raman spectroscopy(SERS) was established for the detection of ciprofloxacin (CIP) residues in duck meat.UV-visible absorption spectrum of SERS enhanced substrate and the feasibility of SERS detection of CIP residues in duck meat were analyzed.The addition amount of gold colloid， addition amount of duck meat extract containing CIP，addition amount of sodium chloride solution and the adsorption time were optimized by the single factor analysis.The calibration curve for the method was obtained in the optimum experiment condition.The determination coefficient was 0.987 9.The average recoveries of CIP in the prediction samples were between 97.0% and 111.7%.The experiment results indicated that the SERS method was feasible for the detection of CIP residues in duck meat.

ciprofloxacin(CIP)；surface enhanced Raman spectroscopy(SERS)；duck meat；detection

2016-12-11；

2017-01-15

国家自然科学基金项目(31660485)；江西省科技厅对外科技合作计划项目(20132BDH80005)；江西省科技厅科技支撑项目(20121BBG70058)；江西省教育厅科技计划项目(GJJ12244)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.023

O657.3；TQ460.72

A

1004-4957(2017)05-0701-04

*通讯作者：刘木华，博士，教授，研究方向：光谱分析与检测，Tel:0791-83813260，E-mail：suikelmh@sohu.com