基于小波-反向搜索及表面增强拉曼的食品中色素的光谱定性分析

彭 颖，张志敏 ，卢红梅*，梁逸曾，刘 察，陈启振，刘国坤

(1.中南大学 化学化工学院，湖南 长沙 410083；2.厦门大学 化学化工学院，福建 厦门 361000； 3.厦门大学 环境与生态学院 海洋环境科学国家重点实验室，福建 厦门 361000)

基于小波-反向搜索及表面增强拉曼的食品中色素的光谱定性分析

彭 颖1,2，张志敏1，卢红梅1*，梁逸曾1，刘 察1，陈启振2，刘国坤3

(1.中南大学 化学化工学院，湖南 长沙 410083；2.厦门大学 化学化工学院，福建 厦门 361000； 3.厦门大学 环境与生态学院 海洋环境科学国家重点实验室，福建 厦门 361000)

使用金纳米粒子为增强因子的表面增强拉曼光谱技术，通过连续小波变换将拉曼光谱信号转化到小波空间(墨西哥帽小波作为小波基)。该步骤能够减轻信号中基线变化及随机噪音的影响并找到峰位置和最佳小波尺度系数。依据小波空间中的信息，对混合物光谱及标准谱光谱进行反向搜索得到反向搜索匹配系数(Reverse match quality，RMQ)，作为判断混合物中目标成分是否存在的依据。该算法可对混合物中的目标物质进行准确定性，并已成功应用于多种食品中色素鉴定。食品中色素的检出率达到99%，且结果稳健，其效果明显优于传统的命中质量系数法(Hit quality index，HQI)。这证实了小波空间反向搜索方法是一种快速而准确的拉曼光谱定性算法。

连续小波变换；反向搜索；表面增强拉曼光谱；快速定性

拉曼光谱分析方法是上世纪20年代逐步发展起来的一门技术。因其只需简单的样品前处理、对样品无损害，并且能提供丰富的结构信息而得到广泛的应用[1-2]。拉曼光谱数千个数据点中包含着物质定性、定量信息，因此拉曼也被称为指纹图谱[3]。然而，对混合物中的特定物质进行定性分析仍是难题和挑战[4-5]。表面增强拉曼光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)具有增强拉曼信号的潜力，可通过纳米级粗糙基底表面或者纳米级金属颗粒使信号得到增强[6]。Tian等[7-8]专注运用各种纳米结构以提高SERS活性，化学合成的金纳米颗粒，可使信号增强104～105倍。但SERS方法在实际分析工作中，依然存在有荧光背景、随机噪声、交替基线、异形峰和样品杂质峰等问题。

为了降低这些问题的影响，研究者们提出了许多算法进行拉曼光谱分析[9-12]。数值微分法常用来得到局部极值，信噪比(Signal-to-noise ratio，SNR)阈值可剔除假阳性。使用特定的标准基将光谱数据转入新的数据空间，可有效发现基于特征检测到的特征峰[13]。Zhang等[14]提出了基于惩罚最小二乘与小波变换的基线校正算法，使用墨西哥帽小波进行峰位置检测，哈尔小波进行峰宽估计，最后采用惩罚最小二乘进行基线拟合。Shao等[15]提出了一种使用小波变换解析近红外光谱中重叠峰的新方法，可以显著提高近红外光谱的分辨率。连续小波变换(Continuous wavelet transform，CWT)能保持原始数据的局部化特征，便于在原始数据中查找特征峰[16]。因此基于小波变换的峰检测算法非常适合拉曼光谱中的峰检测，通过特征峰比对，利于未知物的定性分析[17]。Chen等[18]提出了一种基于小波的峰值检测、洛伦兹拟合和多项式拟合的光谱校正方法，可以大大减少甚至消除拉曼光谱仪之间的系统差异，是一种有效实用的方法。Zhang等[19-20]提出了基于小波峰检测、反向搜索及非负最小二乘的混合物分析方法(Reverse searching and non-negative least square，RSearch-NNLS)，随后又提出了多尺度峰检测方法(Multi-scale peak detection，MSPD)以及递归小波峰检测方法(Recursive wavelet peak detection，RWPD)，通过充分利用小波空间中的其他信息可以准确检测到峰。连续小波变换已经成为峰检测的主流方法之一。然而存在重叠峰、密集峰及弱峰时，基于连续小波变换的峰检测方法未能达到完全满意的效果。基于小波峰检测的反向检索方法，提升了混合物中目标组分自动化检索的能力。反向搜索具有强抗干扰能力，能够自动屏蔽基线与随机噪音并得到稳健的检索结果[21]。

本文针对表面增强拉曼光谱进行定性分析，提出了快速而精准的小波峰匹配算法。本算法基于多尺度峰检测算法(MSPD)以及反向检索方法。通过连续小波变换将信号直接转入小波空间，随后自动选择小波空间中峰信息及其最佳小波系数进行反向检索，得到反向搜索匹配系数(Reverse match quality，RMQ)作为定性依据。本方法已由食品中色素的定性分析实验得到验证，检出率高达99%，其定性结果明显优于传统的命中质量系数法(Hit quality index，HQI)。

1 实验部分

1.1 连续小波变换

连续小波变换具有同时提取时间和频率信息的优点。小波的基底函数，也称作小波母函数，由一组子函数组成，a和b分别表示尺度和偏移常数，分别控制小波的尺度及位移：

*MERGEFORMAT(1)

s(t)表示输入信号，ψ表示经过特定的尺度及位移。因此，连续函数s(t)在尺度系数a和位移b时的连续小波变换的结果如下：

*MERGEFORMAT(2)

1.2 墨西哥小波峰检测

为了能够有效地提取信号信息，小波基需根据信号的特征有目的地进行选择。本研究主要针对具有高度局部化特征的拉曼光谱，因此选择的小波应具有高斯峰及洛伦兹峰的特征。本文选择墨西哥帽小波，其定义如下：

*MERGEFORMAT(3)

峰检测算法包含3个步骤：①通过小波空间中的局部极值找到脊线；②基于脊线位置识别峰；③优化峰检测参数。

连续小波的方法可以非常有效地识别峰。如图1A是1个有5个峰的模拟信号。图1B是其小波系数，图1C是信号的脊线，脊线对应图1B的红色或者黄色区域。脊线是对峰位置的精确判断。

图1 模拟信号的小波系数及脊线 Fig.1 CWT coefficients，ridges of simulated signal with noise and baselineA.signal with noise and baseline;B.CWT coefficients;C.ridges

图2 基于连续小波变换的峰检测及反向检索Fig.2 Dispaly the detected peaks and elucidate the reverse searching procedure

1.3 反向检索算法

在光谱库检索方法中，两个光谱(如未知物光谱和参考物光谱)的匹配程度由命中质量系数(HQI)表征，HQI其定义如下[22]:

*MERGEFORMAT(4)

式中，A表示需要识别的光谱，L表示组成光谱库的参考物光谱,p为向量维数。当未知物光谱与参考物光谱完全相同时，HQI值为1.000，未知物光谱与参考物光谱的相似度越低，此值越接近0。HQI的数值可以用作匹配系数，它假定HQI是1个从0跨越到1的1组值，要验证身份的材料，HQI必须超过预定的阈值。如果光谱中存在基线漂移及荧光背景，会显著影响匹配结果，HQI区分不同材料的效用也将降低[23]。

众所周知，在分析纯物质时，正向搜索优于反向搜索，而反向搜索在分析混合物时有明显的优势。在检索及匹配的过程中，光谱库中标准品光谱作为参考标准，在检索未知物光谱时只选择与参考光谱对应的强度信息，其它干扰信息可以自动忽略。即便未知谱中少量的特征峰处于重叠峰中，反向搜索也能识别出这些峰。此外，基于反向搜索的程序可以模拟人工解谱时进行峰与峰之间的匹配比对，比较稳健有效，而这个过程可以通过连续小波变换的峰检测功能实现[24-25]。

未知谱和参考谱的匹配系数可由以上方法得到。从图2可以了解到连续小波变换及反向搜索的过程。参考光谱为苋菜红色素的标准品光谱，样品谱为含有苋菜红色素的混合物光谱。图2A和C分别表示在小波空间中检索到的脊线。而图2B阐明了反向搜索的程序及检测到的峰，根据脊线，标准谱的峰可用于反向搜索算法。

反向搜索匹配系数(RMQ)的定义为：

(5)

此算法特别适用于混合物检索光谱库，其中pL为向量，pL,i为光谱库中某条光谱第i个特征峰与其尺度最匹配的小波函数的对应的小波系数。pU∩L亦为向量，pU∩L为混合物光谱U与数据库中光谱L匹配上的特征峰，pU∩L表示U与L匹配上的第i个特征峰与其尺度最匹配的小波函数的对应的小波系数。

1.4 试剂与仪器

氯金酸(HAuCl4)、柠檬酸钠、聚酰胺粉(100～200目)、甲醇、乙醇和氨水(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)。亮蓝、苋菜红、诱惑红、日落黄、柠檬黄色素标准品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

文中SERS谱图皆采用B&W TEK(必达泰克光电科技(上海)有限公司)的 i-Raman拉曼光谱仪进行测定。该仪器的激光波长为785 nm，功率为275 mW，10倍物镜下达到样品表面的激光光斑大小约为80 μm。

1.5 SERS增强活性的金纳米粒子的制备及表征

金纳米粒子由厦门市普识纳米科技有限公司提供，粒径约为55 nm，利用经典的柠檬酸钠还原HAuCl4的方法合成而得[26]。制备过程如下：1.2 mL 1%柠檬酸钠迅速加至含有1 mmol/L HAuCl4的100 mL沸水溶液中，继续剧烈搅拌40 min后，得到粒径55 nm左右的红色金纳米溶胶。

1.6 实际样品的前处理及SERS检测

样品的提取预处理过程借鉴传统的聚酰胺粉法，并结合SERS检测的特点进行优化。对于薯片等固体样品，基本步骤如下：①取5 g样品于50 mL离心管中，加入25 mL乙醇溶液，超声5 min。②将该溶液以6 000 r/min转速离心，取上层清液。③于注射器中，取25 mL待测溶液与聚酰胺粉混合，反复抽取吸附多次后挤出液体弃去。④用注射器抽取5 mL水，反复振荡10 s后挤出废液，该步骤重复3次。⑤依次用甲醇甲酸溶液和乙醇重复上述操作。⑥吸取1 mL乙醇氨水溶液，静置1 min后挤出洗脱液待用。整个前处理过程不超过15 min。对于酒品和饮料等液体样品，前处理可略去前述步骤①和②，直接进行聚酰胺萃取步骤，处理时间可控制在10 min以内。需指出，由于SERS的指纹图谱特点，部分液体样品可直接进行检测，而无需任何前处理。

SERS检测步骤如下：取200 mL金纳米溶胶，20 mL pers-A1增强助剂(厦门市普识纳米科技公司提供)与20 mL洗脱液、5 ppm标准样品，混合5 s。根据色素种类进行分类，然后开始拉曼光谱测试，谱图采集时间为5～10 s。

2 结果与讨论

2.1 食品中色素的定性结果

表1中显示了本方法得到小波空间中的反向匹配系数及对应的HQI结果。通常选择0.8作为阈值来判断物质是否存在[27-28]。HQI方法得到的结果范围为0.69～0.96，当检测值低于0.8时，检测结果即为阴性。而本方法得到的RMQ全部高于0.80，大部分结果达到了0.99，表明色素成功检出，检出率高达99%，且结果稳定。因此，基于连续小波及反向搜索的方法在分析混合物时展现了明显优势。

从表中可以看出，HQI在液体样品中的色素检测具有一定的功效性，但对于固体样本其检测能力大大降低，而基于小波-反向搜索的方法均能成功检出色素的存在。可以推断HQI由于受基线及混合物中其他物质造成干扰的影响较大，结果不稳定。而基于小波-反向搜索的方法能够忽略基线、噪声及背景的影响，可得到稳定且准确的结果。

表1 命中质量系数(HQI)及小波空间中反向搜索匹配系数(RMQ)对食品中色素的定性结果Table 1 HQI and RMQ in wavelet space when querying the food sample against the standard spectra

(续表1)

ColorantSampleHQIDetected(HQI)RMQDetected(RMQ)Allurared(诱惑红)Lactobacillusdrink0 9599√0 9982√Meringues0 7968-0 9986√Potatochips0 8475√0 9982√Succade0 6941-0 9953√Vitaminwater0 9473√0 9983√

2.2 小波空间中进行峰检测的优势

当信号转入小波空间中，基线及噪声可以被明显的抑制。峰检测不需对信号进行平滑及基线校正处理。这是MSPD和MassSpecWavelet的主要步骤，若假设信号由下式表达：

S(t)=P(t)+B(t)+C，t∈[t1,t2]

*MERGEFORMAT(6)

P(t)表示峰，B(t)表示微变化的基线，C表示常数基线。t1和t2分别表示峰开始及结束的点。则峰的小波系数可由下式表示：

*MERGEFORMAT(7)

根据小波函数ψ的零均值和二乘范数归一化的要求，上式中小波函数的卷积和常数基线C将为零。当信号中的噪声变成零均值并且独立恒等的分布，那么可以通过相邻点进行平均化实现降噪。信号进行卷积处理时，加权函数可以实现信号的平均和加权平均。连续小波变化可视为通过不同尺度及位移的小波对信号进行卷积。因此，小波空间中的噪声将在某种程度上受到抑制。墨西哥帽小波是对称函数，其基线变化缓慢而单调。因此，小波函数Ψ和单调且缓慢变化背景B的卷积得到的小波系数近似为零。总的来说，常数及缓变的基线都将在连续小波变换的计算程序中自动被移除。

如图3所示，用1组模拟光谱来验证墨西哥帽小波可从基线和噪声中提取峰特征信息。模拟光谱中包含了一组9个高斯峰，基线及随机噪声。在将信号转入小波空间中后，可从图3中发现峰面积与最佳小波尺度系数具有非常强的线性关系。这意味着拉曼光谱特征峰强度信息在小波空间中也得到了保存，而基线及随机噪声被成功移除。根据连续小波变换的特征，可以认为在小波空间中进行定性及定量分析能取得更好的效果。

图3 小波空间进行峰信息提取的优势Fig.3 Advantages of extraction peak information in wavelet space A.simulated data;B.wavelet coefficients of the signal;C.the coefficient of areas of Gaussian peaks and the best scale wavelet coefficients

3 结 论

本文针对表面增强拉曼信号的定性分析，提出了一种基于连续小波变换及反向检索的定性算法。本算法通过连续小波变换将信号转入小波空间中进行峰检测，随后利用小波空间中的峰信息，基于光谱库中已有标准品光谱进行反向检索得到反向搜索匹配系数(RMQ)进行定性结果考察。食品中色素的定性分析实验结果证明本算法快速、可靠、准确，检出率高达99%，明显优于传统的命中质量系数法(HQI)。此外，本研究中发现小波空间中最佳小波尺度系数也可以保存拉曼光谱特征峰强度信息，成为使用连续小波进行定量分析的理论基础。

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Identification of Colorants in Food by Surface-enhanced Raman Spectroscopy and Wavelet-based Reverse Search

PENG Ying1,2，ZHANG Zhi-min1，LU Hong-mei1*，LIANG Yi-zeng1，LIU Cha1，CHEN Qi-zhen2，LIU Guo-kun3

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Central South University，Changsha 410083，China;2.College of Chemistry and Chemical Engineering，Xiamen University，Xiamen 361000，China;3.State Key Laboratory of Marine Environmental Science，College of the Environment and Ecology，Xiamen University，Xiamen 361000，China)

In this study，a gold nanocrystal colloid was used as the enhancement factor for surface-enhanced Raman scattering(SERS).Raman spectra were transformed by continuous wavelet transform(CWT)，and Mexican hat wavelet were chosen as the wavelet basis.This procedure could be used to alleviate the influence of baseline variations and random noise，and find peak positions and the best scale wavelet coefficients of signal.Reverse search method was proposed to compare the spectrum of an unknown sample with a spectrum of standard using the information in wavelet space.Reverse match quality(RMQ)could be obtained automatically to determine whether a substance is present.It was used to identify colorants in a variety of food successfully.The colorants could be identified with 99 percent accuracy.It shows a better performance compared with traditional hit quality index(HQI).The study confirmed that the wavelet-based reverse search is feasible and accurate in qualitative analysis.

continuous wavelet transform;reverse search;surface-enhanced Raman spectroscopy(SERS);rapid qualitative identification

2016-12-07；

2017-01-22

国家自然科学基金资助项目(21375151)；国家重大科学仪器设备开发专项(2011YQ0301240704)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.008

O657.3；TS264.4

A

1004-4957(2017)05-0627-06

*通讯作者：卢红梅，博士，教授，研究方向：化学计量学与智能分析仪器，Tel:0731-88830831，E-mail:hongmeilu@csu.edu.cn