中成药六味地黄丸对急性肾损伤保护作用的研究

王曦烨，李 丹，于佳琪，许 良

(内蒙古民族大学 化学化工学院，天然产物化学及功能分子合成自治区重点实验室，内蒙古 通辽 028042)

中成药六味地黄丸对急性肾损伤保护作用的研究

王曦烨，李 丹，于佳琪，许 良*

(内蒙古民族大学 化学化工学院，天然产物化学及功能分子合成自治区重点实验室，内蒙古 通辽 028042)

利用代谢组学方法研究了六味地黄丸治疗庆大霉素诱导的急性肾损伤的作用机制，并将超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术与主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)相结合来研究正常组、模型组、给药组间生物标记物的变化情况。在PCA与OPLS-DA模型中，正常组、模型组、给药组均可明显区分。共鉴定出17个正常组与模型组间的生物标记物，包括多种磷脂酰胆碱、鞘氨醇、植物鞘氨醇、鞘磷脂(d18∶0/16∶1(9z))、花生四烯酸。与正常组相比，鞘氨醇、植物鞘氨醇、鞘磷脂(d18∶0/16∶1(9z))、花生四烯酸的含量升高，而给药组中这4种化合物的含量下降，因此六味地黄丸可能通过调节这4种生物标记物的含量从而达到治疗庆大霉素诱导的急性肾损伤的目的。该研究为临床上六味地黄丸治疗肾损伤提供了理论依据。

六味地黄丸；急性肾损伤；庆大霉素；超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)；生物标记物

庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，具有性质稳定、抗菌谱广、杀菌力强的特点，与β-内酰胺类抗生素联用能产生很好的协同作用，适用于治疗严重的复杂性细菌感染，尤其被广泛用于革兰阴性细菌的感染。然而，该类抗生素所引起的耳毒性、肾毒性、神经阻断作用和过敏反应严重限制了其进一步推广和应用[1-3]。例如：选择大鼠作为受试动物，若以80 mg/kg/day以上的剂量腹腔连续注射庆大霉素，10 d左右即可出现蛋白尿，同时血尿素氮含量升高，光镜下可观察到近曲肾小管上皮细胞空泡变性、坏死脱落、形成管型，提示庆大霉素已诱导产生了急性肾损伤[4]。因此，庆大霉素致肾损伤的作用机制研究对其临床的合理使用具有十分重要的意义。

六味地黄丸由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻组成，具有滋阴补肾的功效，用于治疗肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、骨蒸潮热、盗汗遗精、消渴等症。大量研究表明,六味地黄丸还具有显著的增强免疫力、抗疲劳、抗衰老、降血压、降血糖、降血脂、促进新陈代谢及强身健体等多种功效[5]。目前，对六味地黄丸的研究主要集中于其有效成分含量测定方面[6-7]，而对于其治疗急性肾损伤的机制研究则鲜见报道。

代谢组学是一门关于生物体内源性代谢物整体及其变化规律的科学，当正常机体受到毒性物质、代谢障碍或生理因素的影响时，代谢物的种类和浓度会发生显著变化。目前，代谢组学方法在疾病的研究方面已有广泛应用[8-10]。本研究利用超高效液相色谱-质谱联用技术对正常大鼠、庆大霉素诱导的急性肾损伤大鼠、应用六味地黄丸治疗后大鼠的血清中内源性小分子进行分析检测，鉴定其结构，并进一步推断相应的代谢通路，进而从代谢组学角度阐述了庆大霉素诱导的急性肾损伤的发病机制及六味地黄丸的治疗机制，从而为临床上六味地黄丸治疗肾损伤提供了理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UPLC色谱仪、xevo G-2S QTOF质谱仪(Waters公司,Massachusetts,USA)。

甲醇、甲酸(Thermo Fisher公司，Waltham,USA)为色谱纯试剂，超纯水由Milli-Q系统(Millipore Corp,Millipore,USA)提供，硫酸庆大霉素注射液(国药集团容生制药有限公司)，六味地黄丸(九芝堂股份有限公司)，血肌酐、尿素氮试剂盒(Sigma-Aldrich公司,St. Louis,USA)。

1.2 色谱-质谱条件

色谱条件：Waters Acquity BEH-C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱温40 ℃，二元线性梯度洗脱：流动相：A为含0.1%甲酸的水溶液，B为甲醇。流动相梯度：0～3 min,8%～80%B；3～6 min,80%～100%B；6～8 min,100%B；8～9 min,100%～8%B；9～11 min,8%B。流速0.4 mL/min;样品进样量10 μL。

质谱条件：ESI离子源，扫描范围：m/z100～1 000,正离子模式条件下，毛细管电压：3 000 V，锥孔电压：40 V，离子源温度：100 ℃，雾化温度：400 ℃，鞘气流速：800 L/h；负离子模式条件下，毛细管电压：2 500 V，锥孔电压：40 V，离子源温度：80 ℃，雾化温度：150 ℃，鞘气流速：600 L/h。质谱以亮氨酸脑啡肽作内标，甲酸钠校正质量轴。

1.3 数据处理

超高效液相色谱-质谱联用数据使用Masslynx V 4.1软件进行峰提取、峰对齐及归一化处理，用EZinfo 2.0软件进行PCA、OPLS-DA分析。通过HMDB 及METLIN 等精确质量检索数据库，筛选出最有可能的化合物，最终通过数据库标准图谱确定标志物的化学结构。

2 结果与讨论

2.1 急性肾损伤模型的建立与验证

2.1.1 急性肾损伤模型的建立 24只雄性Wistar大鼠由内蒙古民族大学附属医院提供，体重(220±10) g，随机分为3组，每组8只：空白对照组(CG)、庆大霉素造模组(MG)、六味地黄丸治疗组(LG)。所有大鼠于实验前1周开始适应环境。对照组大鼠连续15 d腹腔注射生理盐水，第16 d麻醉处死，肝门静脉收集血清，并以3 500 r/min离心10 min，上清液于-20 ℃条件下冷冻。模型组大鼠以0.2 g/kg/day的剂量连续腹腔注射庆大霉素15 d，第16 d以相同的方式处死大鼠。给药组大鼠除每天注射庆大霉素外,再以0.3 g/kg/day的剂量灌胃六味地黄丸，第16 d以相同的方式处死大鼠。所有的肾组织于石蜡中包埋保存。

样品检测前，4 ℃融化样品，在100 μL血液样品中加入400 μL乙腈，旋涡振荡30 s，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，上清液以0.22 μm滤膜过滤，待测。

2.1.2 组织病理学检验与生化参数分析 各组大鼠肾脏的外观显示，模型组中，肾脏发生肿胀且颜色苍白，提示肾脏已发生了严重的病变；而给药组的肾脏在外观上与正常组极为相似，说明六味地黄丸对庆大霉素诱导的急性肾损伤确有治疗作用。

各组大鼠肾脏组织的HE染色图见图1。从图中可以看出，模型组中出现了大量的透明管型及颗粒管型细胞，提示肾小管细胞发生了坏死现象；而给药组中管型细胞的数量明显减少，说明六味地黄丸对肾小管具有一定的保护作用。

各组大鼠血液中血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的含量结果显示，正常组中，血肌酐、尿素氮的含量分别为(0.50±0.02) mg/dL和(22.37±0.78) mg/dL；而在模型组中，二者的数值急剧升高到(1.91±0.33) mg/dL和(91.58±11.32) mg/dL，说明肾功能出现衰竭；给药后，二者含量又分别降低到(0.75±0.22) mg/dL和(37.40±3.60) mg/dL。以上结果说明六味地黄丸对肾功能具有一定的保护作用。

2.2 代谢轮廓分析

利用UPLC-Q-TOF MS 的正、负离子模式对正常组大鼠、模型组大鼠、给药治疗组大鼠进行分析，得到3 组基峰离子流色谱图(图2)。由图2可见，各组大鼠的血液代谢产物得到了良好分离，正离子模式下的响应信号大于负离子模式，并且检测到的物质多于负离子模式。在正、负离子模式下，某些对应峰在3组色谱图间存在着明显差异，提示这些观测结果可能具有统计学意义。

2.3 代谢差异分析

无监督的模式识别方法——PCA分析可以反映数据的原始状态，直观地显示不同样品间的整体差异，故首先对正常组、模型组、治疗组大鼠血液样品进行PCA分析。从图3可以看出，在正离子模式(R2X=0.872 6,Q2=0.715 2)和负离子模式(R2X=0.812 2,Q2=0.687 3)下，3组血液样本均可明显区分，这说明急性肾损伤造模成功，且六味地黄丸对该疾病有明显的治疗效果。

为了找到引起扩张性心肌病的潜在生物标记物，需利用有监督的识别模式——OPLS-DA分析。有监督的模式识别方法可以扩大组间差异，但需利用外部模型验证方法排列实验来证明模型的有效性。从图4A,B可以看出，在正离子模式(R2Y=0.998 3,Q2=0.977 9)和负离子模式(R2Y=0.993 8,Q2=0.946 2)条件下，正常组与模型组大鼠的血液样本可被明显区分。为寻找潜在的生物标记物，采用OPLS-DA对正常组、模型组样本数据进行了分析，得到了正、负离子模式下的S-plot图(见图4C，D)，在图中，“S”曲线中的每一点代表1个变量，变量对分类的重要程度由VIP值的大小来衡量，变量离原点越远，VIP值越大。根据VIP值(VIP>1.0)和P值(P<0.05)可筛选出潜在的生物标志物。

2.4 潜在生物标记物的分析

通过与数据库标准图谱比对，共确定了17种潜在的生物标记物，分别为13种磷脂酰胆碱、鞘氨醇、植物鞘氨醇、鞘磷脂(d 18∶0/16∶1(9z))、花生四烯酸(表1)。其中鞘氨醇对应的分子离子为302.3，主要的二级碎裂离子MS2为284.6,266.5；植物鞘氨醇对应的分子离子为318.3，主要的二级碎裂离子MS2为300.3,282.3,197.2,60.0；鞘磷脂(d 18∶0/16∶1(9z))对应的分子离子为703.6，主要的二级碎裂离子MS2为685.7；花生四烯酸对应的分子离子为305.2，主要的二级碎裂离子MS2为274.8,236.9,164.9,162.8。这4种化合物在模型组中的含量显著高于正常组；大鼠经六味地黄丸治疗后，这4种物质的含量相对于模型组又显著降低，提示六味地黄丸可能通过影响这4种潜在生物标记物的代谢通路从而达到治疗急性肾损伤的目的。与急性肾损伤相关的潜在生物标记物的信息见表1。

表1 与庆大霉素诱导的急性肾损伤相关的潜在生物标记物Table 1 Potential biomarkers related to gentamicin-induced AKI

*the content of model group compared with control group

2.5 讨 论

溶酶体是真核细胞中的一种细胞器，内含脂肪酶、蛋白酶、核酸酶、β-葡萄糖苷酶等多种水解酶，能够分解各种内源性的大分子物质，如鞘磷脂、鞘氨醇、磷脂酰胆碱等[11]。长期或过量注射庆大霉素将导致其在溶酶体中的聚集，从而导致溶酶体水解功能的丧失，此时大分子物质不会在溶酶体中分解[12]。随着庆大霉素在溶酶体中增多，溶酶体负荷也越来越大，最终达到临界点时破裂，这时各种水解酶从溶酶体中溢出，进而造成细胞自溶和近端肾小管的损伤[13]。

磷脂酰胆碱是细胞膜脂质双分子层的重要组成部分，能够参与多种代谢过程与信号传导。溶酶体破裂后，大量的磷脂酰胆碱释放到血液中。然而，经六味地黄丸治疗后，这些磷脂酰胆碱的含量并未下降，说明六味地黄丸对磷脂酰胆碱这类物质并无明显的调节作用。溶酶体的破裂还会导致鞘磷脂、鞘氨醇、植物鞘氨醇、花生四烯酸的含量升高。鞘磷脂在细胞生长、分化、迁移、凋亡等多种过程中均能起到至关重要的作用。研究证实，鞘磷脂在体内的累积会导致尼曼-匹克氏疾病的发生[14]。鞘磷脂代谢紊乱与肾脏老化及慢性肾病的发展有关，这些疾病会造成肾组织结构及功能的改变，从而进一步引起脑卒、心肌梗死、心力衰竭等一系列的心脑血管疾病[15]。糖尿型肾病是糖尿病的主要微血管并发症之一，病人血液中植物鞘氨醇、鞘氨醇的含量明显升高，这说明糖尿型肾病与植物鞘氨醇、鞘氨醇的代谢失调具有一定的关联性[16]。溶酶体的破裂还能够导致磷脂酰胆碱含量的升高，而花生四烯酸是磷脂酰胆碱下游的代谢产物之一，含量也随之升高。花生四烯酸能够进一步转化为前列腺素、血栓素、白三烯等类花生酸类物质，这些化合物能够介导多器官及生理系统的炎症反应。如血栓素A2能够加重脓毒症所诱导的急性肾损伤[17]，白三烯在氧自由基的作用下能够形成脂质自由基并造成细胞损害[18]。六味地黄丸给药后，鞘磷脂、鞘氨醇、植物鞘氨醇、花生四烯酸的含量显著降低，表明六味地黄丸可能通过对以上4种生物标记物含量的调节进而达到治疗庆大霉素诱导的急性肾损伤的目的。

3 结 论

本研究应用代谢组学方法研究了中成药六味地黄丸治疗庆大霉素诱导的急性肾损伤的作用机制，并鉴定出17种潜在的生物标记物。实验结果表明，六味地黄丸可能通过调节鞘磷脂、鞘氨醇、植物鞘氨醇、花生四烯酸的含量进而达到治疗急性肾损伤的目的。本文的研究结果为临床上六味地黄丸治疗急性肾损伤提供了理论依据。

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Study on Protective Effect of Chinese Patent Medicine Liuwei Dihuang Pill on Acute Kidney Injury

WANG Xi-ye,LI Dan,YU Jia-qi,XU Liang*

(Inner Mongolia Key Laboratory for the Natural Products Chemistry and Functional Molecular Synthesis,College of Chemistry and Chemical Engineering,Inner Mongolia University for the Nationalities,Tongliao 028042，China)

Metabonomics technology was used to investigate the mechanism of Liuwei Dihuang Pill treating acute kidney injury induced by gentamicin.The ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS) coupled with principle component analysis(PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis(OPLS-DA) were used to evaluate the changes of biomarkers of control group,model group and treatment group.Significant differences between the control group,model group and treatment group were observed in clustering analysis,PCA and OPLS-DA model.Seventeen potential biomarkers between control group and model group were identified as multiple phosphatidycholines,sphinganine,phytosphingosine,SM(d18∶0/16∶1(9z)),arachidonic acid.The relative contents of sphinganine,phytosphingosine,SM(d18∶0/16∶1(9z)) and arachidonic acid increased in model group compared with control group,while decreased in treatment group.Therefore,Liuwei Dihuang Pill may achieve the aim to treat acute kidney injury induced by gentamicin through adjusting the content of these biomarkers.This study provides a theoretical basis for Liuwei Dihuang Pill treating kidney injury in clinical practice.

Liuwei Dihuang Pill;acute kidney injury;gentamicin;UPLC-MS;biomarker

2016-12-05；

2016-12-29

国家自然科学基金(81260682，81560702)；内蒙古自治区天然产物化学及功能分子合成重点实验室开放课题 (MDK2016011);内蒙古民族大学校级课题(NMDYB1727)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.007

O657.63；R978.1

A

1004-4957(2017)05-0621-06

*通讯作者：许 良，博士，教授，研究方向：天然产物化学，Tel:13947521310，E-mail:nmgxl66@163.com