UPLC-MS/MS同时检测苹果及其制品中的7种真菌毒素

张晓男，聂继云，闫 震，程 杨，王玉娇

(中国农业科学院 果树研究所/农业部果品质量安全风险评估实验室(兴城)，辽宁 兴城 125100)

研究报告

UPLC-MS/MS同时检测苹果及其制品中的7种真菌毒素

张晓男，聂继云*，闫 震，程 杨，王玉娇

(中国农业科学院 果树研究所/农业部果品质量安全风险评估实验室(兴城)，辽宁 兴城 125100)

建立了苹果及5种苹果制品中7种真菌毒素(PAT，OTA，AOH，AME，ALT，TEN，TeA)的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。准确称取苹果及5种苹果制品各10 g(液体样品量取10 mL)，加入10 mmol/L柠檬酸乙腈溶液进行提取，再加入4 g 4A型分子筛和1 g氯化钠除水盐析，离心后上清液采用C18净化，最后采用0.22 μm聚四氟乙烯膜(PTFE)过滤进行UPLC-MS/MS检测。7种真菌毒素在2～150 μg/L范围内线性关系良好(r2>0.99)；检出限为0.02～1.8 μg/L，方法定量下限为1～5 μg/L。以10，50，100 μg/L浓度水平做加标回收实验，回收率为71.8%～112.4%。此方法快速、高效，为苹果及其制品中真菌毒素污染的风险监测奠定了基础。

真菌毒素；超高效液相色谱-串联质谱；4A分子筛；苹果；苹果制品

苹果是我国第一大果品[1]，至2014年，中国苹果栽培面积和产量分别达到2 272.2×104hm2和4 092.32×104t，占全国水果栽培面积的18.4%和水果产量的15.65%[2]。除鲜食外，我国每年还有大量苹果用于加工，在生产过程中，果实难免受到真菌病害侵染产生真菌毒素，从而对苹果及其制品造成污染。研究表明，污染苹果及其制品的真菌毒素主要棒曲霉素(Patulin，PAT)[3]、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)[4]、交链孢酚(Alternariol，AOH)、交链孢酚单甲醚(Alternariolmonomethyl ether，AME)、交链孢烯(Altenuene，ALT)、腾毒素(Tentoxin，TEN)和细交链孢酮酸(Tenuazonic acid，TeA)[5]7种。目前，果品及其制品中真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法[5]、高效液相色谱法[6]、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[6-9]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[10]等。有效的前处理方法是实现仪器分析的前提保证，目前用于真菌毒素分析的前处理方法包括免疫亲和柱法[11]、多功能柱法[12]、QuEChERS方法[13]等。然而，这些方法检测的真菌毒素种类有限，无法满足苹果及其制品中主要真菌毒素的同时检测需求。本文以上述7种真菌毒素为对象，对样品的提取净化方法、色谱条件、质谱条件、基质效应等展开研究。通过筛选和优化，提出适于苹果及其制品中上述7种真菌毒素的前处理方法，建立了同时检测苹果及其制品中7种真菌毒素的UPLC-MS/MS方法，从而为苹果及其制品中真菌毒素污染的风险监测与评估奠定了方法基础。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

甲醇、乙腈、甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸、柠檬酸(色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司)；C18(50 μm，60 Å)、PSA(40 μm，100 g)(美国Varian 公司)；无水MgSO4(优级纯，天津市津科精细化工研究所)；NaCl(优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；4A型分子筛(钠-A型分子筛，国药集团化学试剂有限公司)；有机滤膜(美国FINE Scientific公司)； PAT，AOH，AME，ALT，TEN，TeA，OTA标准品(纯度≥98%，新加坡Pribolab公司)。

超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS Xevo TQ，美国Waters公司)；立式大容量高速离心机(CF16RXⅡ，日本Hitachi公司)；全自动超纯水制水机(Milli-Q Direcet 8，美国Millipore公司)；马弗炉(M110，美国Thermo公司)；色谱柱(美国Waters公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 标准贮备液：准确称取1 mg标准品于10 mL 容量瓶中，乙腈定容，配成100 mg/L的标准贮备液，储存于-20 ℃冰箱中备用。基质空白标准工作溶液：利用本实验前处理方法分别制备苹果、苹果汁、苹果酒、苹果醋、苹果酱、苹果罐头的基质空白溶液，然后用基质空白溶液将标准贮备液稀释至1，2，5，10，50，100，200 μg/L 7个浓度水平。

1.2.2 样品前处理 分别准确吸取10 mL苹果汁、苹果醋、苹果酒样品于50 mL 具塞离心管中，苹果、匀浆后的苹果罐头和苹果酱则称取10 g，加入10 mL提取液(10 mmol/L柠檬酸乙腈溶液)，剧烈振荡3 min，然后加入4 g 4A型分子筛(400 ℃下烘干3 h，立即移至干燥箱中冷却至室温后使用)和1 g NaCl，剧烈振荡1 min，9 000 r/min离心5 min，取2 mL上清液转移至15 mL离心管中，加入60 mg净化剂C18，涡旋振荡1 min，静置2 min，上清液过0.22 μm PTFE有机系滤膜，待测。

1.2.3 UPLC-MS/MS条件 色谱条件：Cortecs UPLC C18色谱柱；柱温：35 ℃；流动相：A为甲醇，B为1 mmol/L乙酸铵；梯度洗脱程序：0～0.5 min，3%A；0.5～3.5 min，3%～90%A；3.5～4.5 min，90%A；4.5～4.6 min，90%～3%A；4.6～5.5 min，3%A；流速：0.3 mL/min；进样体积：5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正负同时扫描；毛细管电压：0.5 kV；检测方式：多反应监测(MRM)；离子源温度：150 ℃；去溶剂气温度：400 ℃；去溶剂气和锥孔气均为高纯氮气，流速分别为800 L/h和50 L/h；碰撞气：高纯氩气，流速 0.14 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱及柱温的选择

对比了BEH C18色谱柱[5,14-15]、BEH Hilic色谱柱和Cortecs UPLC C18色谱柱对7种真菌毒素的分离效果。结果表明，BEH Hilic色谱柱分析7种真菌毒素的出峰时间主要集中在0.85～1.05 min，不能将7种真菌毒素很好地分离。Cortecs UPLC C18色谱柱分析7种真菌毒素的峰形和响应值优于BEH C18色谱柱，对Cortecs UPLC C18色谱柱的柱温(30，35，40，45 ℃)进行了优化，结果表明，当柱温为35 ℃时，7种真菌毒素的峰形、响应值最好。本实验最终采用Cortecs UPLC C18色谱柱进行分离，柱温为35 ℃。

2.2 色谱-质谱条件的优化

比较研究了甲酸[16]、乙酸[17]、缓冲盐、乙酸铵[18]和水共5种水相与乙腈[19]、甲醇[20]2种有机相作为流动相时7种真菌毒素的分离效果。结果表明，以甲醇-乙酸铵作为流动相体系时，7种真菌毒素的峰形得到明显改善，离子信号值增强，分离度较好，响应值为3.67×104～2.50×106。进一步优化乙酸铵浓度(0.5，1.0，5.0，10.0，50.0 mmol/L)，结果表明乙酸铵浓度为1.0 mmol/L时，7种真菌毒素的出峰效果最佳。因此，实验最终确定以甲醇和1.0 mmol/L乙酸铵作为流动相。

液相色谱分离时，若流动相为酸性，调低毛细管电压可以提高检测物质的灵敏度[21]。本实验中流动相pH值为6.0，提取液pH值为3.79～5.77，当降低毛细管电压至0.5 kV时，7种真菌毒素的响应值得到提高。所以本研究最终采用0.5 kV的毛细管电压。采用流动注射泵连续进样方式对MRM质谱条件进行优化，分别在ESI+模式和ESI-模式下扫描，最终确定7种真菌毒素的MRM参数见表1。由于基质影响差别不大，以苹果基质为例，50 μg/L混合标准溶液及50 μg/L加标苹果样品中7种真菌毒素的定量离子质谱图见图1。

表1 7种真菌毒素的串联质谱检测参数Table 1 MRM parameters for 7 mycotoxins analyzed

2.3 样品前处理的优化

本研究对前处理过程的提取溶剂、除水剂、净化剂和滤膜进行优化，分别考察了苹果及其制品共6种不同基质，结果表明5种苹果制品和苹果的前处理条件并无差异，因此以苹果基质作为代表，讨论了样品前处理的优化结果。

图2 柠檬酸浓度对7种真菌毒素回收率的影响Fig.2 Effect of citric acid concentration on recoveries of 7 mycotoxins

图3 C18用量对7种真菌毒素回收率的影响Fig.3 Effect of C18 use level on recoveries of 7 mycotoxins

2.3.1 提取溶剂的优化 选用极性和毒性均较低的乙腈[20]作为提取溶剂，并比较了乙腈、甲酸-乙腈[22]、乙酸-乙腈[23-24]、柠檬酸-乙腈[25]4种溶剂对7种真菌毒素回收率的影响。结果表明，采用纯乙腈或乙酸-乙腈进行提取时，TeA的回收率不足50%；甲酸-乙腈提取时TeA的回收率为60.1%～68.6%；柠檬酸-乙腈提取时TeA的回收率为61.7%～78.8%，表明以柠檬酸-乙腈提取时的效果较好。进一步优化了柠檬酸的浓度(1，5，10，50，100 mmol/L)，结果表明，以10 mmol/L柠檬酸-乙腈为提取溶剂时效果最好，7种真菌毒素的回收率为78.8%～116.6%，因此最终选择10 mmol/L柠檬酸-乙腈作为提取溶剂(图2)。

2.3.2 除水剂的优化 比较了4A型分子筛和无水MgSO4对7种真菌毒素回收率的影响。结果表明，当使用无水MgSO4时，7种毒素的回收率为54.7%～109.7%，使用4A型分子筛时的回收率为81.6%～109.5%，表明4A型分子筛的提取效果高于无水MgSO4。这是由于4A分子筛是一种有效孔径为0.4 nm的人工合成、具有微孔型立方晶格的硅铝酸盐，能有效吸附水、NH3、H2S、二氧化硫、二氧化碳等临界直径不大于0.4 nm 的分子，而本研究的7种真菌毒素的直径均大于0.4 nm，不会被吸附，提取过程损失小，4A型分子筛用量对回收率无明显影响，故本实验采用4 g 4A分子筛作除水剂。2.3.3 净化剂的优化 比较了净化剂C18和PSA对7种真菌毒素回收率的影响。结果表明，PSA对OTA有明显的吸附作用，添加PSA净化后，OTA的添加回收率小于10%。因此采用C18作为净化剂进行净化，并比较了C18用量(0，15，30，60，120 g)对样品中7种真菌毒素回收率的影响。结果表明，每毫升提取液中加入30 mg C18时，7种真菌毒素的回收率为77.5%～103.7%(图3)，净化效果好，回收率高。2.3.4 滤膜的选择 比较了尼龙膜(Nylon)、聚醚砜膜(PES)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、混合纤维素酯(MCE)和聚四氟乙烯膜(PTFE) 5种一次性滤膜对7种真菌毒素回收率的影响。结果表明，Nylon膜会对AOH和AME产生明显的吸附作用，PES膜对AME产生吸附作用。采用PTFE膜时，7种真菌毒素的回收率为96.4%～106.5%，能有效过滤杂质和最大限度减少样品损失，因此本实验选择0.22 μm的PTFE滤膜进行过滤。

2.4 基质效应

基质效应(Matrix effects，ME)是指色谱分离时，共洗脱的物质使目标分析物的检测灵敏度和准确性降低的现象[26]。选取6种100 μg/L的基质空白标准工作溶液与溶剂标准溶液比较，按照公式ME=(A-B)/B×100%计算7种真菌毒素在不同基质中的基质效应[27]，其中A和B分别为空白基质标准溶液和溶剂标准溶液的响应值。当平均基质效应(增强或抑制)超过20%，则认为基质效应对定量检测具有显著影响。结果表明，基质对多数真菌毒素均存在显著影响(见表2)。本研究在优化色谱-质谱分析条件的基础上，采用样品空白基质配制标准曲线对7种真菌毒素进行定量分析，以补偿基质效应。

表2 7种真菌毒素在不同样品中的基质效应Table 2 Matrix effects of 7 mycotoxins in different samples

(续表2)

MycotoxinMatrixeffect(%)AppleApplejuiceApplewineAppleacidApplejamCannedappleALT74 0303 988 52 9263 5179 8TEN39 1-42 512 60 6-49 0-98 9TeA11 265 14 215 834 0-45 0

2.5 方法学评价

2.5.1 标准方程、相关系数、检出限与定量下限 在优化条件下，用苹果空白基质配制一系列质量浓度(2，5，10，50，100，150 μg/L)的真菌毒素溶液，上机检测。结果表明7种真菌毒素在2～150 μg/L范围内具有良好的线性关系，r2≥0.992 8。检出限(S/N=3)为0.02～1.80 μg/L，采用加标回收的方法得出方法定量下限，设置1，2，5 μg/L加标水平，计算回收率，获得7种真菌毒素的方法定量下限(S/N=10)为1～5 μg/L(见表3)。

表3 7种真菌毒素的线性方程、检出限及定量下限Table 3 Linear equations,LODs and LOQs of 7 mycotoxins

x：concentration(μg·L-1)；y：response

2.5.2 回收率与精密度 在苹果及其制品中分别添加10，50，100 μg/L 3个浓度水平的混合标准溶液，进行加标回收率实验，每个浓度水平重复5次。结果表明，7种真菌毒素的回收率为71.8%～112.4%(见表4)。本方法对苹果及其制品中不同含量的7种真菌毒素的回收率均符合NY/T 788-2004标准[28]。

表4 苹果及其制品中7种真菌毒素的加标回收率Table 4 Spiked recoveries of 7 mycotoxins in apple and its products

(续表4)

SampleMycotoxinAdded10μg/LAdded50μg/LAdded100μg/LRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)AppleacidPAT102 66 494 14 599 85 8OTA97 312 698 48 397 82 4AOH91 35 495 62 499 23 0AME99 65 299 96 698 83 1ALT103 71 096 18 295 46 6TEN103 810 099 13 198 96 0TeA87 25 592 01 293 37 6ApplejamPAT98 712 698 33 998 61 6OTA99 95 3102 74 799 31 5AOH91 92 9102 81 499 21 6AME88 512 398 14 6100 05 8ALT93 54 898 26 199 61 8TEN101 612 498 36 4101 75 3TeA88 53 288 03 890 53 5CannedapplePAT98 712 597 92 0100 11 2OTA99 77 6103 33 5100 21 0AOH98 67 199 22 799 72 0AME95 75 199 43 699 02 5ALT105 67 9101 60 899 91 6TEN95 312 790 215 3100 010 3TeA90 88 893 82 390 41 6

2.6 实际样品的检测

采用本方法检测20个苹果、41个苹果汁、10个苹果酒、34个苹果醋、14个苹果酱、5个苹果罐头共124个样品。结果显示，6类样品中真菌毒素的检出率分别为0，17.1%，2.9%，0，0，21.4%。其中，苹果汁中检出PAT(11.1～13.8 μg/L)，AOH(0.28～3.7 μg/L)，AME(0.6～0.81 μg/L)，ALT(0.48～1.1 μg/L)，TEN(2.2～3.1 μg/L)和TeA(11.9～20.6 μg/L) 6种真菌毒素，苹果醋中检出AME(1.77 μg/L)和TeA(14.5 μg/L)两种真菌毒素，苹果酱中检出AME(1.17～4.42 μg/L)和TEN(10.1 μg/L)两种真菌毒素。表明方法可用于实际样品的检测。

3 结 论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱同时检测苹果及5种苹果制品中7种真菌毒素的定量分析方法，并采用了新型除水剂4A型分子筛。本方法在检测速度、灵敏度、准确度、精密度、成本、环保以及检测真菌毒素种类方面有显著改进和优势，适合于此类真菌毒素在苹果及其制品中污染水平的研究。

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Simultaneous Detection of 7 Kinds of Mycotoxins in Apple and Its Products by UPLC-MS/MS

ZHANG Xiao-nan,NIE Ji-yun*,YAN Zhen,CHENG Yang,WANG Yu-jiao

(Institute of Pomology,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Fruit (Xingcheng),Ministry of Agriculture,Xingcheng 125100,China)

A rapid and accurate method was developed for the determination of 7 mycotoxins (PAT,OTA,AOH,AME,ALT,TEN and TeA) in apple,apple juice,apple wine,apple acid,apple jam and canned apples by UPLC-MS/MS.10 g of the sample(10 mL of liquid sample) was precisely weighed,and extracted with acetonitrile containing 10 mmol/L citric acid solution,then 4 g of 4A molecular sieve and 1 g of NaCl were added.After oscillation and centrifugation,the liquid supernatant was purged with C18decontaminant.Finally,it was filtered through a 0.22 μm PTFE membrane and analyzed by UPLC-MS/MS.The method showed good linear relationships for 7 mycotoxins in the concentration range of 2-150 μg/L with correlation coefficients above 0.99.The detection limits were in the range of 0.02-1.8 μg/L,and the limits of quantitation were 1-5 μg/L.The recoveries of 7 mycotoxins were between 71.8% and 112.4% at three spiked concentrations levels of 10,50,100 μg/L.This method is rapid and efficient in the simultaneous detection of 7 mycotoxins in apple and its products.This will lay a foundation for the risk monitoring of mycotoxin contamination in apple and its products.

mycotoxin;UPLC-MS/MS;4A molecular sieve;apple;apple product

2017-02-03；

2017-03-14

农产品质量安全风险评估重大专项(GJFP2016003,GJFP2017003)；中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ASTIP)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.002

O657.63;S852.44

A

1004-4957(2017)05-0588-07

*通讯作者：聂继云，博士，研究员，研究方向：果品质量安全，Tel:0429-3598178，E-mail:jiyunnie@163.com