稳定同位素内标/超高压液相色谱-串联质谱法同时测定水果与豆芽中10种植物生长调节剂残留

刘柏林，谢继安，赵紫微，王秀莉，单晓梅

(安徽省疾病预防控制中心，安徽 合肥 230601)

稳定同位素内标/超高压液相色谱-串联质谱法同时测定水果与豆芽中10种植物生长调节剂残留

刘柏林*，谢继安，赵紫微，王秀莉，单晓梅

(安徽省疾病预防控制中心，安徽 合肥 230601)

建立了水果与豆芽中10种植物生长调节剂残留的超高压液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析方法。以酸化乙腈(1∶1 000，体积比)为提取液，样品经高速匀浆与超声辅助分散提取后，提取液采用固相萃取柱净化，甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液为流动相，梯度洗脱，电喷雾电离，正负离子扫描，多反应监测模式(MRM)检测，基质匹配同位素内标标准曲线定量。最优条件下，10种植物生长调节剂残留在0.1～50.0 μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.995，检出限为0.2 μg/kg，平均回收率为52.4%～119.6%，相对标准偏差(RSD)均小于13%。该方法样品前处理简单、净化效果好，同位素内标的使用解决了基质效应及前处理过程中待测物损失造成定量结果不准确的问题，适用于大批量果蔬中多种植物生长调节剂的快速测定。

超高压液相色谱-串联质谱法；植物生长调节剂；同位素内标；水果；豆芽

植物生长调节剂( Plant growth regulator,PGRs) 是一类人工合成的农药，具有与天然植物激素相似的生理和生物学效应,有促进植物生长，或延缓、抑制功能[1]，能够提高作物产品质量和品质、增强果实抗病力、延缓果实成熟等作用。随着植物生长调节剂在农业方面的广泛使用，其毒性与危害引起了人们的关注。研究表明，残留在农作物中的植物生长调节剂可通过食物链进入人体，轻者造成腹泻等疾病，重者使人体免疫力下降，骨骼疏松，甚至有致畸、致癌、致突变等严重后果[2]。

针对植物生长调节剂残留问题，国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission,CAC)、美国、欧盟、日本、澳大利亚等组织和发达国家相继制定了最大残留限量标准(Maximum residue limits,MRLs)[3-4]。在中国，随着“毒豆芽”与“爆炸西瓜”事件的发生，植物生长调节剂的安全性受到广泛关注，现行有效的国家标准GB2763-2014中制定了2，4-二氯苯氧乙酸、多效唑、氯吡脲、噻苯隆的最大残留限量。但植物生长调节剂种类繁多，在最大残留限量制定方面均不完善，分析方法的研究显得尤为重要。当前，植物生长调节剂的检测方法主要有高效液相色谱法[5]、液相色谱-质谱联用法[6-12]、气相色谱-质谱联用法[13-14]。其中液相色谱-质谱联用法以其抗干扰能力强、灵敏度高,并能提供结构方面的信息确证而被更多采用[6]，而已报道的液相色谱-质谱联用法大多使用基质外标法定量，很少有同位素内标法定量的报道[15]。对基质复杂的蔬菜、水果样品，基质效应是存在的。解决基质效应的最好方法是基质加标或同位素内标法，而基质加标法需制备工作曲线，一般很难找到合适的空白本底的基质样品。采用同位素内标法很好克服了这一缺点，降低了基质效应的影响，避免了待测物在样品前处理过程中的损失，从而保证了测定结果准确可靠。

本文建立了UPLC-MS/MS 同位素内标法同时测定水果与豆芽中10种植物生长调节剂残留的分析方法。通过对色谱条件、质谱条件、样品前处理进行优化，同位素内标法进行校正，使得本方法灵敏度高、准确性好，适合于大批量水果与蔬菜样品中多种植物生长调节剂的同时测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AcquityTMUPLC超高压液相色谱仪、串联质谱仪(ZEVO TQ MS)、8010G样品均质杯均购自美国Waters公司；VORTEX Gnius 3旋涡混匀器(德国IKA公司)；MCS固相萃取柱、SLC固相萃取柱(500 mg，6 mL，杭州福裕科技服务有限公司)。

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D，纯度≥99.0%)、脱落酸(纯度≥98.5%)、吲哚乙酸(纯度≥99.5%)、吲哚丁酸(纯度≥99.9%)、赤霉素(纯度≥94.7%)、4-氯苯氧乙酸(纯度≥99.5%)、氯吡脲(纯度≥99.0%)、噻苯隆(纯度≥99.5%)、6-苄基腺嘌呤(纯度≥99.0%)、多效唑(纯度≥99.5%)购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；2，4-二氯苯氧乙酸-d5(纯度≥98.5%)、吲哚乙酸-d7(纯度≥99.2%)、氯吡脲-d5(纯度≥98.7%)购自加拿大C/D/N Isotopes公司；甲醇、甲酸、乙腈、氨水(色谱纯,德国Merck公司)；乙酸铵(色谱纯,Sigma公司)。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液：分别取适量的标准物质及同位素内标物质，用甲醇溶解，并定容至刻度，配制成100 μg/mL的标准储备液，避光保存于-20 ℃冰箱；混合标准工作液：准确移取适量标准储备液至容量瓶中，用10%甲醇水溶液稀释至刻度，混匀，配制成100 ng/mL的混合标准工作液；准确移取适量同位素内标标准储备液至容量瓶中，用10%甲醇水溶液稀释至刻度，混匀，配制成100 ng/mL的混合内标工作液，现配现用。

1.3 超高压液相色谱(UPLC)条件

色谱柱:Waters AcquityTMUPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；柱温:40 ℃；样品室温度10 ℃；进样体积:10 μL；流动相:A为5 mmol/L乙酸铵，B为甲醇；流速:0.3 mL/min；梯度洗脱条件：0 ～1 min，0～2%B；1～2 min，2%～30%B；2～4 min，30%～95%B；4～5 min，保持95%B；5～6 min，95%～2%B；6～8 min，保持2%B。

1.4 质谱条件

离子源:电喷雾离子源；电离模式:ESI+和 ESI-；检测方式:多反应监测(MRM)；毛细管电压:3.8 kV(ESI+)和2.4 kV(ESI-)；离子源温度:150 ℃；脱溶剂气温度:500 ℃；脱溶剂气流量:800 L/h；碰撞气流量:0.13 mL/min。待测物的母离子、子离子及对应的碰撞能量、锥孔电压见表1。

表1 10种待测物及同位素内标的质谱参数Table 1 MS/MS conditions for the analysis of ten analytes and internal standards

*quantitation ion

1.5 样品处理

提取：称取样品 5.00 g(精确至0.01)于50 mL离心管中，加入500 μL混合内标工作液、20 μL甲酸和20 mL乙腈，高速旋涡混匀1.0 min后，超声 5 min,冷却，10 000 r/min离心 5 min，上清液转移至新的50 mL 离心管中，然后加入 2.0 g NaCl(使其饱和有结晶)，旋涡混匀 2 min后于 10 000 r/min离心5 min，吸出2.0 mL乙腈置于试管中，50 ℃下用氮气吹干，加入0.2 mL甲醇旋涡溶解，再加入 3.0 mL 40 mmol/L盐酸溶液混匀，转移至离心管内于10 000 r/min离心5 min，分出上清液净化。

净化：先用5 mL甲醇、 5 mL水、5 mL 40 mmol/L的盐酸溶液活化 MCS柱，活化结束后，将上清液转移至MCS柱内，待样品通过后，用 5 mL水淋洗除杂，真空抽干5 min，依次加入5 mL甲醇、5 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集于10 mL具塞试管内，50 ℃下氮气吹干，加入0.13 mL甲醇超声溶解残留物，再加入0.87 mL 纯水混匀，过0.22 μm滤膜后待测。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

分别将10种植物生长调节剂配成浓度为1.0 μg/mL的标准溶液，使用Waters TQ MS自动调谐分析，正、负离子模式下进行全扫描,确定10种待测物的母离子及锥孔电压,在此锥孔电压下，选取强度较高的两个子离子分别作为定量和定性离子，以MRM模式优化碰撞能量等质谱参数，定性、定量离子和质谱参数见表1。赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、噻苯隆、6-苄基腺嘌呤、氯吡脲、吲哚乙酸、吲哚丁酸在正负离子模式下均有响应，但吲哚乙酸、吲哚丁酸与氯吡脲在负离子模式下的离子强度低于正离子模式下。综合考虑各待测化合物的灵敏度和基质干扰程度，除氯吡脲、多效唑、吲哚乙酸、吲哚丁酸选用正离子模式外，其余待测物均选择负离子模式。

2.2 流动相的优化

比较了不同流动相对待测物峰形及离子化效率的影响。结果表明，甲醇作为有机相时，各待测物的响应较好,离子强度高,离子化效率优于乙腈。当水相中加入0.1%甲酸时，负离子的离子化效率受到抑制，加入0.01%氨水时，吲哚乙酸与吲哚丁酸的响应降低，而加入乙酸铵缓冲盐后，待测物分离度增大，峰形尖锐对称。基于灵敏度的考虑，选择甲醇作为有机相，5 mmol/L乙酸铵溶液作为水相。10种植物生长调节剂标准溶液及同位素内标的色谱图如图1。

2.3 样品溶剂的优化

考察了不同体积比的甲醇-水溶液作为溶剂溶解样品时对色谱峰形的影响。实验表明，纯甲醇作溶剂时，与流动相不匹配而产生溶剂效应，待测物的色谱峰展宽最严重，甲醇含量降低时，柱效增加，峰形变窄，灵敏度变高。对氮气吹干后的残留物进行复溶时，甲醇含量低不能完全溶解残留在离心管壁上的待测物，导致部分待测物的回收率偏低。综合考虑，采用13%甲醇作为标准曲线系列的定容溶剂，复溶残渣时，先加入0.13 mL纯甲醇溶解，后加入0.87 mL纯水定容，确保定容溶剂中甲醇含量一致。

图1 基质匹配标准溶液及同位素内标的色谱图(添加浓度为5.0 ng/mL)Fig.1 Chromatograms of matrix matching and isotope internal standard(5.0 ng/mL)

2.4 样品净化的优化

已有文献多采用分散固相萃取法净化以达到快速、简便的目的，但使用分散固相萃取法净化时，样品提取液中含有高浓度的有机溶剂，限制了仪器的进样量，影响灵敏度。另外，分散固相萃取法使用的吸附剂材料取决于待测物的结构，不同的待测物，选取的吸附剂材料不同，检测植物生长调节剂的吸附剂材料一般为N-丙基乙二胺(PSA)、C18和石墨化炭黑(GCB)，而这些材料吸附的机理不同，除去的杂质也不同。实验比较了分散固相萃取与阳离子交换柱两种净化方法，发现阳离子交换柱净化能够更好地除去水果样品中的色素，增加结果的准确性，避免假阳性。另外，比较了MCS与SLC柱2种混合型的阳离子交换柱的净化效果，发现吲哚丁酸在SLC柱上没有保留，经柱净化后的加标回收率低。因此，本实验选择MCS柱净化样品，以解决色素残留问题，提高样品净化效果，同时获得理想的内标回收率，该条件下的平均回收率大于97%。

2.5 内标物的选择

在质谱检测中，选取与待测物结构一致的同位素内标进行定量，其定量结果可根据不同基质对待测物响应的抑制进行平行削减，以获得较高的定量准确性[16]。但同位素内标物的价格较高，种类较少，往往缺乏与待测物结构对应的内标物。本实验考察了同位素内标校正不同待测物的回收率，最终选取3种氘代同位素内标，其中多效唑、6-苄基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、吲哚丁酸、赤霉素以氯吡脲-d5作为内标，吲哚乙酸、脱落酸以吲哚乙酸-d7作为内标，2，4-D以2,4-D-d5作为内标。

2.6 基质效应的影响

基质曲线作用在于补偿基质抑制和增强效应，基质效应严重时会影响定量的准确性。本实验考察了基质效应的影响，以阴性样品提取液为溶剂，配制10.0 ng/mL 的混合标准溶液，测定其峰面积为A；以样品溶剂(13%甲醇)配制10.0 ng/mL的混合标准溶液，测定其峰面积为B，计算基质效应ME(%)=B/A×100，其中ME>100% 说明有基质增强效应，ME<100% 说明有基质抑制效应[17]。由表2可以看出，样品基质对目标化合物存在一定的影响，除了赤霉素与4-氯苯氧乙酸具有基质抑制效应外，其余化合物均表现为基质增强效应。为提高定量的准确度，本实验选取阴性样品的基质提取液作为标准溶液的稀释液，并加入同位素内标进行校正。

2.7 标准曲线、检出限与定量下限

选取阴性样品，按照样品前处理的步骤进行处理，制备样品基质提取液，准确移取混合标准工作溶液于容量瓶中，加入500 μL内标混合标准工作液和适量的上述基质提取液，用13%甲醇水溶液定容至刻度，配制成0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/L的标准系列。进样10 μL分析，以待测物峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x，μg/L)为横坐标，绘制标准曲线。结果显示，各待测物均在质量浓度为0.1～50.0 μg/L的范围内与其峰面积呈良好的线性关系，相关系数均大于0.995(见表2)。

表2 10种待测物的线性方程、相关系数、检出限、定量下限及基质效应Table 2 Linear equations,correlation coefficients,LODs,LOQs and matrix effects for ten analytes

添加0.2 μg/kg浓度时，10种待测物峰的信噪比(S/N)均大于3，故将其定为检出限。定量下限定义为在获得满意的回收率和相对标准偏差条件下，可以检测到的样品溶液中目标化合物的最低浓度，故本方法中10种待测物的定量下限为2.0 μg/kg，方法的灵敏度可满足GB/T27404-2008实验室质量控制规范的相关要求。

2.8 精密度与回收率

称取(5.00±0.01) g阴性样品，添加混合标准溶液，使加标浓度分别达到1.0，4.0，20.0 μg/kg，加入同位素内标混合液，按照样品前处理方法进行处理，上机测定，每个添加水平进行5次实验。结果如表3所示，平均回收率为52.4%～119.6%，相对标准偏差(RSD)为1.0%～12.3%。实际样品分析发现水果中存在内源性物质脱落酸影响低浓度的测定，加标回收时，适当增加添加量的浓度，可确保结果的准确性，故添加量分别选为10.0，20.0，100.0 μg/kg。

表3 样品中10种待测物的加标回收率及相对标准偏差(n=5，%)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of ten analytes in the actual samples(n=5，%)

*the additions of abscisic acid were 10.0,20.0，100.0 μg/kg in fruit,and 1.0，4.0，20.0 μg/kg in bean sprout

2.9 实际样品的测定

采用本方法对超市与农贸市场采集的100份水果、80份豆芽进行测定，水果中植物生长调节剂的检出率为20.0%，其中葡萄、猕猴桃中的2，4-D、4-氯苯氧乙酸、赤霉素与氯吡脲的检出率较高，最高浓度分别达到0.041 7，0.033 2，0.021 7，0.041 5 mg/kg。除GB2762-2014规定葡萄与猕猴桃中氯吡脲的最大残留限值为0.05 mg/kg，葡萄中2，4-D的最大残留限值为0.1 mg/kg外，水果中4-氯苯氧乙酸和赤霉素尚无限量标准，而猕猴桃中的2，4-D也无限量标准。豆芽中植物生长调节剂的检出率为38.0%，主要为4-氯苯氧乙酸、6-苄基腺嘌呤、赤霉素和吲哚乙酸，检出值范围分别为0.006 1～1.01，0.004 3～0.045，0.005 7～0.071，0.006～1.81 mg/kg，这4种待测物在豆芽中均无限量标准，但有文献报道吲哚乙酸是豆芽内源性生长素[13]，是否属人为添加还需大量的实验数据。

3 结 论

本文建立了水果与豆芽中10种植物生长调节剂残留的UPLC-MS/MS分析方法。与已报道的方法相比，该法采用基质匹配，同位素内标校正，解决了基质效应问题，提高了定量的准确性与可靠性，适合于大批量样品中植物生长调节剂残留的快速检测。

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Simultaneous Determination of Ten Plant Growth Regulator Residues in Fruit and Bean Sprout by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Stable Isotope-labelled Internal Standards

LIU Bo-lin*，XIE Ji-an，ZHAO Zi-wei，WANG Xiu-li,SHAN Xiao-mei

(Anhui Provincial Center for Disease Control and Prevention，Hefei 230601，China)

A method for the determination of ten plant growth regulator residues in fruit and bean sprout by ultra performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS) was established.The samples were extracted by the stirring and ultrasound using formic acid-acetonitrile(1∶1 000),and purified with the solid phase extraction column.The analytes were separated by using methanol-5 mmol/L ammonium acetate as mobile phase.The identifications were achieved by the electrospray ionization in positive and negative mode(ESI+/ESI-) using the multiple reaction monitoring(MRM).The quantifications were performed by the matrix matched isotope-labelled internal standards.Under the optimal experimental conditions,the calibration curves of ten analytes showed good linearities in the concentration range of 0.1-50.0 μg/L with correlation coefficients(r2) above 0.995.Recoveries were between 52.4% and 119.6% with RSDs less than 13.0%.The limits of detection were 0.2 μg/kg.The method had the advantages of simple pretreatment,good purification and low matrix effects,and was suitable for the rapid,high-throughput quantitative analysis of plant growth regulator residues in fruit and bean sprout.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；plant growth regulator；isotope-labelled internal standards；fruit；bean sprout

2016-12-26；

2017-01-23

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.004

O657.63；S143.8

A

1004-4957(2017)05-0601-06

*通讯作者：刘柏林，硕士，主管检验师，研究方向：理化分析，Tel:0551-63674883，E-mail：liubolin087@163.com