苏黄止咳胶囊对呼吸道合胞病毒作用的体外实验研究※

李俊英 李际强

(广东省广州市萝岗区中医医院内科，广东 广州 510530)

苏黄止咳胶囊对呼吸道合胞病毒作用的体外实验研究※

李俊英 李际强△

(广东省广州市萝岗区中医医院内科，广东 广州 510530)

目的 观察苏黄止咳胶囊对呼吸道合胞病毒(RSV)导致病变的体外抑制作用。方法 接种RSV long株于人肺癌细胞(A549)，采用细胞病变效应法(CPE)，观察苏黄止咳胶囊与三拗片体外对RSV的作用。结果 药物在A549细胞上的半数毒性浓度(TC50)：三拗片为3.85 mg/mL，苏黄止咳胶囊为4.09 mg/mL，利巴韦林为3.58 mg/mL。苏黄止咳胶囊在无毒浓度1.36 mg/mL、三拗片在0.62 mg/mL、利巴韦林在0.625 mg/mL下能完全抑制RSV。结论 苏黄止咳胶囊与三拗片均有一定的抗RSV作用，为2种药物临床治疗呼吸道病毒感染性疾病提供一定的实验室依据。

呼吸道合胞病毒；药物作用；中药；胶囊；药理学

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染是临床常见的呼吸道病毒感染性疾病，临床发病率高，尤其儿童更易发病，咳嗽或哮喘为临床常见表现[1]。临床研究认为，苏黄止咳胶囊治疗呼吸道病毒感染后咳嗽疗效较好[2-3]。三拗片是治疗呼吸道病毒感染风寒袭肺证较有效的药物[4-5]。本实验研究了苏黄止咳胶囊与三拗片对RSV导致病变的抑制作用，结果如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 苏黄止咳胶囊(扬子江药业集团北京海燕药业有限公司，国药准字Z20103075，批号：15060312)，三拗片(江苏济川制药有限公司，国药准字Z20090708，批号：1505123)。实验时将2种药物分别加纯水完全溶解后分管，置80 ℃间歇灭菌3 d，离心后无菌分管放置冰箱存放备用。阳性药物：利巴韦林(原料药，纯度>98%，购自广东肇庆鼎湖药业有限公司，批号：20140825)。

1.1.2 细胞与病毒 人肺癌细胞(A549)，购于中山大学医学院实验中心，经广州中医药大学热带医学研究所病毒室传代保种。RSV long株引自美国典型培养物保藏中心(ATCC，编号为VR-26)，并于人肺癌细胞(A549)中传代扩增及测定病毒滴度。经测定RSVlong株在人肺癌细胞(A549)上的半数组织培养感染剂量(TCID50)为7.0。

1.1.3 主要试剂及仪器 小牛血清；DMEM培养基(美国GIBCO公司)；二氧化碳(CO2)恒温培养箱(Real Force，型号：HF90/HF240)；通用型酶标仪(Bio-tek instrument，INC.型号：ELX800)；倒置显微镜(Olympus，型号：CK40)；生物安全柜(Haier，型号：HR40-ⅡA2)

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 精密称取苏黄止咳胶囊与三拗片2个样品，用足量三蒸水充分浸泡溶胀后置于60 ℃水浴2 h后离心，取上清液后隔水蒸腾浓缩至母液浓度，苏黄止咳胶囊为434.1 mg/mL，三拗片为296.8 mg/mL，母液以间歇灭菌法除菌(80 ℃水浴30 min，连续3 d)，离心分装冻于-20 ℃备用。精密称取利巴韦林0.052 4 g，用无菌DMEM培养基5.2 mL充分溶解后，0.22 μm过滤除菌分装冻于-20 ℃备用，母液浓度为10.0 mg/mL。

1.2.2 药物细胞毒性实验 在96孔培养板内，每孔加入(2.0×103个/mL)的人肺癌细胞(A549)，37 ℃、5%CO2培养，待细胞长成单层后，另加入不同浓度的药物，每个药物8个浓度，每浓度4孔。逐日观察细胞病变，培养6 d后则终止实验，受试样品对细胞的毒性作用通过四甲基偶氮唑盐(MTT)染色法进行测定。并计算出药物的半数毒性浓度(TC50)。实验时设阳性药利巴韦林对照、正常细胞对照。根据MTT染色读取490 nm下的光密度值(OD值)，参照文献[6]方法计算各药物各浓度下对细胞的毒性作用和TC50。公式如下：

A=log>50%药物浓度 B=log<50%药物浓度 C=A-B

1.2.3 药物体外抑制作用实验[7]常规复苏培养并消化人肺癌细胞(A549)，用DMEM培养基调整接种密度至2.0×105个/mL，以0.1 mL/孔接种于96孔一次性培养板上，37 ℃、5%CO2培养至紧密单层后备用。选取无毒浓度作为药物的实验对象。先将稀释好的各浓度的药物接种于96孔细胞板上，每个样品浓度接种4个细胞复孔，加样后直接接种100TCID50病毒悬液100 μL继续培养6 d，35 ℃、5%CO2。同时设置阳性药利巴韦林对照、病毒对照和正常细胞对照(用于与实验药物对照，表中不显示)，实验结束后以显微镜观察，细胞病变效应法(CPE)评价受试样品对病毒的抑制作用。

2 结 果

2.1 各药物在人肺癌细胞(A549)上的毒性作用 见表1。

表1 各药物在人肺癌细胞(A549)上的毒性作用

注：“-”表示对细胞完全无毒

由表1可见，药物在人肺癌细胞(A549)上的TC50：三拗片为3.85 mg/mL，苏黄止咳胶囊为4.09 mg/mL，利巴韦林为3.58 mg/mL。

2.2 各药物在人肺癌细胞(A549)上对RSV导致病变的抑制作用 见表2。

表2 各药物在人肺癌细胞(A549)上对RSV导致病变的抑制作用

注：“⊙”表示样品对细胞具有毒性作用，造成细胞破碎、固缩等；药物对照中“-”表示无毒、无病变；药物加病毒中“-”表示细胞病变程度<10%，“+”表示细胞病变程度25%～50%，“++”表示细胞病变程度50%～70%，“+++”表示细胞病变程度75%～90%，“++++”表示细胞病变程度>90%

由表2可见，苏黄止咳胶囊在无毒浓度1.36 mg/mL、三拗片在0.62 mg/mL、利巴韦林在0.625 mg/mL下能完全抑制RSV。

3 讨 论

RSV是一种RNA病毒，属副黏液病毒科，该病毒常经空气飞沫或密切接触传播，是儿童呼吸道感染最常见的病原体之一，儿童RSV相关下呼吸道感染常见为毛细支气管炎和肺炎，发病率高，其中部分患儿需要住院治疗，甚至死亡，严重威胁患儿生命健康。同时RSV感染还与此后的喘息发作及哮喘关系密切[8]，因此RSV感染的预防和治疗十分重要。

中医学在治疗呼吸道病毒感染方面积累了丰富的经验，但目前研究多集中于清热解毒类药物，金银花在体外可能通过直接灭活、阻止病毒吸附和抑制生物合成3种方式发挥抗RSV作用[9]；连翘、野菊花提取物等均有体外抑制RSV作用[10-11]。我们发现呼吸道病毒感染的患者风寒证或兼夹风邪证占据了较大的比例[12]，临床上“治风”为主的苏黄止咳胶囊及治疗风寒袭肺证的三拗片已广泛应用。苏黄止咳胶囊根据国医大师晁恩祥“风咳”理论组方而成，由麻黄、紫苏叶、地龙、蜜枇杷叶、炒紫苏子、蝉蜕、前胡、炒牛蒡子、五味子等组成。其中麻黄散寒平喘，为君药；五味子、紫苏叶收敛肺气，止咳化痰，为臣药；前胡、紫苏子助麻黄疏散风邪，降气止咳，为佐药；配以蝉蜕、地龙加强其疏风散邪功效，并利咽止痒。诸药共奏疏风宣肺、解痉止咳之功[13]。三拗片源于《太平惠民和剂局方》三拗汤，由麻黄、杏仁、甘草及生姜等组成，方中麻黄为君，发散表邪，宣畅肺气；杏仁为臣，降气止咳化痰；二药配伍，一宣一降，调畅气机，用于咳嗽痰多。生姜温肺止咳；甘草补脾益气，止咳祛痰，调和药性，二药共为佐使。现代药理研究表明，麻黄水提液在体外实验中对RSV有一定抑制作用[14]；甘草能够对人体进行免疫调节，减轻气道炎症，并对多种呼吸科常见致病细菌(葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等)及病毒(RSV、流感病毒等)均有一定抑制作用[15]；紫苏叶单味药有较好的体外抗RSV作用[16]。

本实验研究结果表明，苏黄止咳胶囊在无毒浓度1.36 mg/mL、三拗片在0.62 mg/mL下能完全抑制RSV，二者均有较好的抗呼吸道病毒作用，并且显示了较低的细胞毒性。对照药物利巴韦林在体外有较好的抗RSV作用，但其在临床由于疗效一般、成本高及使用繁琐，并有研究表明利巴韦林和抗生素治疗RSV引起的毛细支气管炎可能无效[17]，临床上较少应用。2种中成药组方简单，携带、服用方便，除了本实验提示的抗RSV作用外，还有较好的止咳、化痰、平喘等作用[18-19]，具有较好的应用前景。本研究结果为2种药物临床治疗呼吸道病毒感染性疾病提供一定的实验室依据，有待进一步深入研究，以阐明药物的作用机制。

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(本文编辑：习 沙)

Effects of Suhuang-zhike capsule on respiratory syncytial virus in vitro experimental study

LIJunying*,LIJiqiang.

*DepartmentofInternalMedicine,LuogangDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicineinGuangzhouCity,Guangdong,Guangzhou510530

Objective To observe the inhibitory effect of Suhuang-zhike capsule on respiratory syncytial virus-induced (RSV-induced) desease. Methods RSV long strain was inoculated in A549 cells to observe the effects of Suhuang-zhike capsule and San'ao piece on RSV in vitro by cytopathogenic effect inhibition. Results Median toxic concentration (TC50)on A549 cells: San'ao piece was 3.85 mg/mL, Suhuang-zhike capsule was 4.09 mg/mL, and ribavirin was 3.58 mg/mL. Suhuang-zhike capsule was able to inhibit RSV completely at 0.63 mg/mL of non-toxic concentration, San'ao piece was 0.62 mg/mL, and ribavirin could inhibit RSV at 0.625 mg/mL. Conclusion Suhuang-zhike capsule and San'ao piece have a certain effect of anti-RSV, and provide a certain laboratory basis for clinical treatment of respiratory virus infectious diseases.

Respiratory syncytial virus; Drug effect; Traditional Chinese medicine; Capsules; Pharmacology

※ 项目来源：2013年度广东省自然科学基金面上项目(编号：S2013010012179)

李俊英(1975—)，女，主治医师，学士。从事中西医结合治疗内科疾病的临床与研究工作。

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.04.023

R373.1；R965；R285.5

A

1002-2619(2017)04-0575-04

2016-05-12)

△ 通讯作者：广州中医药大学第二附属医院综合三科，广东 广州 510006