离子液体分散液—液微萃取—高效液相色谱法测定碳酸饮料中合成着色剂

孙鹏，竺鉴博，高玉玲

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.大庆市萨尔图区市场监督管理局食品药品服务中心）

离子液体分散液—液微萃取—高效液相色谱法测定碳酸饮料中合成着色剂

孙鹏1，竺鉴博2，高玉玲1

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.大庆市萨尔图区市场监督管理局食品药品服务中心）

建立了一种离子液体分散液液微萃取样品前处理技术，结合高效液相色谱法测定液态奶中2种着色剂（胭脂红、日落黄）。考察了萃取剂种类、萃取剂体积、分散剂种类、pH、盐浓度等因素对萃取效率的影响。确定了最佳萃取条件：以160 μL 1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[OMIM]PF6）为萃取剂，1 000 μL乙腈为分散剂，NaCl质量分数为6%，pH为4.5。结果表明：2种合成着色剂在1～250 μg·L-1范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为0.998 8～0.999 2；检出限分别为1.27 μg·L-1和0.43 μg·L-1，加标回收率在88.7%～98.5%，RSD在1.3%～5.4%。该方法简单、高效、安全，能够满足碳酸饮料中合成着色剂的检测要求。

离子液体；高效液相色谱；分散液液微萃取；合成着色剂

人工合成着色剂是一类重要的食品添加剂，具有色泽鲜艳、性质稳定、着色力强、调色容易、成本低廉等诸多优点，被广泛用于食品生产加工行业中[1-2]，给人们的身体健康带来巨大隐患。合成色素是以苯、甲苯、萘等化工产品为原料，经过一系列有机反应制成的，不但没有任何营养价值，过量的食用会对人体造成严重的伤害。饮料中添加合成着色剂的现象非常普遍，且存在超限量使用现象，所以对其含量的测定显得尤为重要[3-4]。随着社会的发展人们生活水平不断提高，食品安全问题已被人们越来越重视。因此建立一种方便、快捷、稳定、可靠的检测方法才能满足市场需求。

已报道的合成着色剂主要检测方法有高效液相色谱-串联质谱法[5-6]、高效液相色谱法（HPLC）[7-8]、细管电泳法（CE）[9]等。胭脂红、日落黄是饮料中最常使用的着色剂，有关胭脂红、日落黄的检测方法有分光光度法、液相色谱法、液相色谱质谱联用法等，光度法适合检测含量较高的样品，液质仪器和耗材价格昂贵，故液相色谱法应用最为广泛。

常用的前处理技术有固相萃取法、聚酰胺粉吸附法、液-液提取法，但样品前处理技术需消耗大量有机试剂，对环境产生污染。液-液微萃取以消耗试剂少、简单、廉价等优点，已经发展成为一种新的前处理技术[10-11]。离子液体（ILs）具有熔点低、热稳定性好、能够溶解各种有机和无机化合物、易与其他溶剂混溶等独特的物理和化学特性，是一种环境友好的溶剂，成为分析工作者的新宠，并作为一种新型绿色溶剂，现已广泛应用在分析工作中[12-14]。目前已有报道使用离子液体液-液微萃取前处理应用在农残、兽残检测中，但有关此法应用在碳酸饮料中胭脂红、日落黄的检测未见报道。研究首次采用离子液体分散液-液微萃取前处理技术，结合高效液相色谱测定碳酸饮料中胭脂红、日落黄，该方法具有操作简单、成本低廉和环境友好等优点。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司），配有紫外检测器（美国Waters公司）；Z36HK型高速冷冻离心机（德国HERMIE公司），VORTEX-2型涡旋仪（美国SI DIGITAL），SK8200H型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）；ML204电子分析天平（梅特勒-托利多），PE-20型pH计（梅特勒-托利多）。

试剂：1-己基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐（[HMIM]OTF）（阿拉丁试剂（中国）有限公司，纯度95%）、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[OMIM]PF6）（阿拉丁试剂（中国）有限公司，纯度95%）、胭脂红（ponceau 4R，GBW（E）100161）、日落黄（sunset yellow，GBW（E）100159），于4℃下冷藏保存。甲醇、乙醇、乙腈、丙酮均为色谱纯（德国Fisher试剂公司）。柠檬酸（分析纯，天津科密欧试剂有限公司）、氯化钠（国药试剂，分析纯，使用前于650℃灼烧4 h），250 μL内插管（美国Waters公司），0.22 μm微孔滤膜（天津博纳艾杰尔），实验所用水为屈臣氏蒸馏水，实验所用的碳酸饮料在超市购买。

1.2 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5C18，5 μm；150 mm× 4.6 mm；流速：1.0 mL·min-1；流动相：甲醇+乙酸铵（0.02 mol·L-1）（5+95）；检测波长：254 nm；柱温：室温；进样量：10 μL。

1.3 样品测定

准确量取20.0 mL碳酸饮料样品放入50 mL的烧杯中，在35℃下微热不断搅拌驱除二氧化碳，然后用0.22 μm滤膜过滤，用0.1 mol·L-1柠檬酸溶液调节pH值为4.5，向样品中加入160 μL[OMIM]PF6（萃取剂），1 000 μL乙腈（分散剂），加入NaCl质量分数为6%，涡旋震动3 min，室温10 000 r·min-1离心3 min，将离心管取出后，用微量进样器取底层萃取剂样品50 μL，加入到250 μL内插管中，待高效液相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

2.1.1 萃取剂的选择

实验考察了[OMIM]PF6和[HMIM]OTF 2种咪唑类离子液体对合成着色剂萃取效率的影响。结果表明[OMIM]PF6对胭脂红、日落黄有更好的富集效果，且试验结果稳定，见图1。故试验选择[OMIM]PF6为萃取剂。

图1 萃取溶剂种类、体积对回收率的影响Fig.1Effect of type and volume of extraction solvent on recoveries

实验还考察了萃取剂的用量对萃取的影响。随着[OMIM]PF6量的增加，萃取回收率不断增加，见图2。实验考察了120、140、160、180、200 μL，当加入160 μL[OMIM]PF6时，萃取回收率达到最大值并趋于稳定，故实验选择萃取剂最佳量为160 μL。

图2 分散剂体积对萃取回收率的影响Fig.2Effect of volume of dispersant solvent on recoveries

2.1.2 分散剂的选择

分散剂对目标化合物的测定不产生干扰，在萃取过程中分散剂最大限度的增加萃取剂与目标溶液的接触面积，进而增大萃取效率。试验考察了乙醇、甲醇、丙酮、乙腈为分散剂对胭脂红、日落黄回收率的影响。由图3可见乙醇、丙酮、甲醇作为分散剂时萃取回收率都比较低，并且实验重复性差，故实验选择甲醇为分散剂。同时优化了分散剂的用量，考察了分散剂体积为600、800、1 000、1 200、1 400、1 600 μL时对萃取结果的影响，回收率表明当甲醇用量为1 000 μL时，回收率高。

图3 分散剂类型对萃取效率的影响Fig.3Effect of type of dispersant on recoveries

2.1.3 pH的选择

调节样品溶液的pH值可通过改变溶液的酸碱性，进而改变分析物的状态，影响分析物的稳定性及存在形式，从而影响萃取率。故pH值是影响液相萃取的另一主要因素。因此选择合适的样品溶液pH值对萃取操作很重要。胭脂红、日落黄在酸性条件下稳定性较好，实验考察了pH为3.0～6.0范围对萃取结果的影响见图4，pH=4.5时，胭脂红、日落黄能够与萃取剂形成稳定的体系。

图4 pH值对萃取效率的影响Fig.4Effect of pH on recoveries

2.1.4 NaCl质量分数的选择

在萃取剂和分散剂用量分别为160μL和1000μL，pH=4.5时，考察NaCl质量分数对萃取效率的影响。盐的加入可以增大水相的离子强度，降低目标化合物在水相的溶解度，进而提高目标物在离子液体中的萃取效率。实验考察了NaCl质量分数为2%～12%对萃取效率的影响。结果表明，随着盐用量的增加，萃取效率增大，当盐浓度在6%时，萃取效率最佳（见图5）。故试验选择NaCl质量分数为6%。

图5 NaCl质量分数对萃取效率的影响Fig.5Effect of NaCl mass fraction on recoveries

2.2 方法的评价

2.2.1 线性关系和检出限、定量限

在最佳的实验条件下，从加标碳酸饮料样品中萃取2种合成着色剂类残留进行HPLC测定，以碳酸饮料中加标1～250 μg·L-1考察方法标的线性范围、相关系数、检出限，分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算检出限和定量下限，结果见表1。

表1 3种合成着色剂的相关系数、线性范围、检出限、定量限、相对标准偏差Table 1Correlation coefficients，linear ranges，LOD，LOQ，RSD of two kinds of synthetic colorants

2.2.2 回收率和精密度

以阴性碳酸饮料样品作为空白基质，分别在5、10、20 μg·L-1共3个水平进行农药加标回收试验，评价方法的准确度和精密性。日内精密度是在1天内平行分析6次加标样品所得回收率的RSD，日间精密度通过连续3天分析同一浓度加标样品所得回收率的RSD，由表2可知2种合成着色剂加标回收率在88.7%～98.5%，日内及日间精密度均低于5.5%。

表2 碳酸饮料中2种合成着色剂在3个加标水平的回收率和精密度Table 2Recoveries and RSDs of synthetic colorants spiked in carbonated drink at three levels

3 样品分析

在最佳条件下对阴性碳酸饮料样品、加标样品、市售碳酸饮料进行离子液体分散液—液微萃取—高效液相色谱分析。阴性碳酸饮料样品、加标样品、实际样品、标准溶液的色谱图见图6，市售碳酸饮料胭脂红未检出，日落黄检出浓度为42.6 μg·L-1。

图6 （a）空白样品、（b）加标样品、（c）实际样品、（d）标准溶液（1.胭脂红、2.日落黄）Fig.6Chromatograms of（a）negative sample，（b）spiked sample，（c）real sample，（d）standard solution（1.ponceau 4R，2.sunset yellow）

4 结论

建立了离子液体分散液液微萃取结合高效液相色谱法测定碳酸饮料中2种合成着色剂的方法。离子液体分散液液微萃取方法操作简便，利用此法取代传统液液萃取使用大量有机试剂，使得样品前处理过程更加方便、安全、环保。但该方法在选择萃取剂时存在一定局限性，导致部分化合物回收率偏低，今后合成适合研究领域的离子液体用于萃取将成为研究热点。

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Simultaneous Determination of Synthetic Colorants by Ionic Liquid Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography in Carbonated Drink

Sun Peng1，Zhu Jianbo2，Gao Yuling1
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Food and Drug Service Center of Market Supervision Administration，Sartu District）

A novel method for the determination of two synthetic colorants ponceau 4R and sunset yellow from the carbonated drink was developed using ionic liquid dispersive 1iquid-liquid microextraction coupled with high performance liquid chromatography.The influence of extraction parameters including types of extraction solvent，volume of extraction solvent，types of dispersant solven，pH，sodium chloride mass fraction were investigated.Using 160 μL 1-octyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate（[OMIM]PF6）as extraction drop，1 000 μL acetonitrile as dispersant solvent，sodium chloride mass fraction 6%，pH was adjusted 4.5 Under the optimal condition，good linear relationship was obtained in the two synthetic colorants concentrations of 1-250 μg·L-1with the correlation coefficients of 0.998 8-0.999 2；the detection limits were 0.43-1.27 μg·L-1.The proposed method was applied to the determination of two synthetic colorants in carbonated drink，the recoveries were from 88.7%to 98.5%，with the corresponding relative standard deviations were from 1.3%to 5.4%.The method was simple，fast and precise to satisfy，which could meet the requirements for the determination of synthetic colorants in carbonated drink.

ionic liquid；performance 1iquid chromatography；dispersive 1iquid-liquid microextraction；synthetic colorants

O658.2

A

1002-2090（2017）03-0065-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.03.014

2016-08-05

大庆市指导性科技计划项目（szdfy-2015-50）；黑龙江八一农垦大学（校内培育课题资助计划：XZR2014-17）。

孙鹏（1982-），男，助理研究员，黑龙江八一农垦大学毕业，现主要从事农产品农药残留、兽药残留检测技术研究。