“重组DNA分子的模拟操作”实践与反思

高小燕（厦门市集美中学，福建厦门361021）

“重组DNA分子的模拟操作”实践与反思

高小燕
（厦门市集美中学，福建厦门361021）

将“重组DNA分子的模拟操作”实验与相关练习题有机结合，有利于促进学生在操作、思考、讨论的过程中建构、理解与应用生物学概念，提高探究能力与实践能力，发展生物学核心素养。

重组DNA分子；模拟操作；探究能力

一、“重组DNA分子的模拟操作”内容分析

“DNA重组技术的基本工具”一节主要介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。DNA重组技术抽象，尽管教科书以类比的方式将DNA重组技术的三种基本工具形象化，如将限制性核酸内切酶比喻成“手术刀”、将DNA连接酶比喻成手术时用到的缝合针、将基因进入受体细胞的载体比喻成“分子运输车”，但相当一部分学生还是难以将“酶”与其熟悉的“手术刀”相联系，DNA重组技术的三种基本工具及其作用是学生学习的难点。

“重组DNA分子的模拟操作”将三种DNA重组工具具体化，使得学生认识到剪刀代表的是限制酶EcoRI，它识别的序列是G-A-A-T-C序列，并且在G和A之间剪切开。当学生用红色透明胶或订书钉时，知道只能连接被限制酶（剪刀）剪切的磷酸二酯键处，而不能去黏连氢键等。

二、“重组DNA分子的模拟操作”方法与结果

课前要求学生根据基因重组的原理，设计“重组DNA分子的模拟操作”所需要的材料与用具。学生选用红色的儿童手工卡纸表示目的基因所在的DNA片段，以绿色手工卡纸表示环形质粒载体，剪刀代表EcoRI限制酶，还有红色胶布及订书机等实验用具。

1.剪切。分组开展“重组DNA分子的模拟操作”实验。每组学生只能利用EcoRⅠ限制酶，且只能利用一种DNA连接酶。

学生先从绿色纸条的双链DNA中分别选出EcoRI限制酶所识别的GAATTC序列。根据EcoRI限制酶的特性，在G-A之间用代表EcoRI限制酶的剪刀进行“切割”获得载体。由于限制酶切割的位点是磷酸二酯键，并没有作用于氢键，此时学生会有疑问，为什么氢键也被“切割”了？教师应当进行适时指导，指出用剪刀和限制酶的区别在于限制酶仅作用于磷酸二酯键，而剪刀实际将氢键也切割开了。

“切割”获得绿色载体后，用同样的方法将红色纸条代表的DNA片段中的目的基因截取出来。此时，许多学生仅发现一个EcoRI限制酶的识别序列，教师可提醒其思考，如果只“切割”一次，那么获取的目的基因是哪段？如何与载体相连？同时，学生选择教师提供的直线形或圆环形载体，并思考与讨论载体切割后形成的DNA片段解决裁体有1个酶切位点或多个酶切位点等问题。

2.拼接。红色、绿色两种卡纸的切割位点全部切开后，学生根据所学的DNA连接酶相关知识，相同的黏性末端在DNA连接酶的作用下进行连接。用红色胶布或订书钉代表连接酶，完成一个重组DNA分子的模拟操作。并指导学生比较本组的拼接结果与其他组的结果，思考“为什么自己的拼接结果与其他组的不一样？”分析原因，相互质疑，促进学生重新审视、正确认识限制酶、DNA连接酶的特点。

3.模拟操作结果。①红色、红色相连接（如图1），即目的基因与目的基因连接成环状。②绿色、红色相连接（如图2、图3），即目的基因与载体相连接。③绿色、绿色头尾相连接（如图4），即载体与载体相连接。

图1 目的基因与目的基因环状连接

图2 目的基因与环状载体连接

图3 目的基因与载体连接

图4 环状载体与载体连接

此外，有的小组将目的基因或载体用“限制酶”酶切后，在原磷酸二酯键处重新连接。说明学生对限制酶作用特点“具有相同黏性末端的都可以连接”认识不够全面，故应用相应练习题进行辨析。

三、“重组DNA分子的模拟操作”辨析与应用

例题1据下列图表回答问题：

三种限制酶特异识别的序列及切割位点图示

（1）假设题目中涉及的三种限制酶能将相对应的酶切位点完全剪切开，如果采用EcoRI和PstI酶切含有目的基因的DNA片段，可以能得到______种DNA片段。如果将质粒和含有目的基因的DNA片段只用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶连接，可以形成的连接产物有________、________、_________。

（2）剪切之后的目的基因末端和质粒载体末端可能会出现任意连接，酶切时最好选用选用的酶是__________、___________，可以一定程度减少无用连接。

学生1分析，该题主要考查限制酶和连接酶的特点。限制酶的特点是识别特定的DNA序列，且切割位点一定。连接酶的特点是根据碱基互补配对原则，相同的黏性末端均可连接。

学生2分析，第1小题的第一个空格，要求答出形成的DNA片段。由于目的基因所在的DNA片段上具有两个EcoRI酶切位点和一个PstI酶切位点，采用这两种酶进行酶切，正如模拟操作中用剪刀模拟限制酶，切三次，应该形成4个片段。

学生3分析，该题目要求质粒和DNA片段只用EcoRI一种酶酶切，根据限制酶的特点，目的基因两端和质粒被限制酶酶切位点的黏性末端是一样，根据DNA连接酶作用特点，只要黏性末端一样即可连接。因此，有的小组将剪切开的绿色纸条和绿色纸条用胶布粘在一起，也有的将绿色纸条和红色纸条粘在一起，还有的将红色纸条和红色纸条粘在一起。所以，在拥有许多个质粒DNA、许多个目的基因所在DNA片段的前提下，可以有三种连接产物即质粒—质粒、质粒——目的基因、目的基因—目的基因连接产物。

教师提问：这三种连接中，哪种才是基因工程需要的？如何减少其他两种错误连接？学生思考与讨论后得出：使得黏性末端多样化。这样就需要使用多种限制酶，但质粒上只有SmaI和EcoRI两种限制酶，所以答案就显而易见了。

教师补充：是不是用这两种酶切割就能完全杜绝错误连接？激发学生思维冲突，因为学生发现即使应用这两种限制酶，也只能减少错误连接，但不能杜绝错误。因此，运用例题2进一步辨析。

例题2（2016年全国I卷）某一质粒载体如图所示。外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用Bam HⅠ酶切后，与用Bam HⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。

学生4分析：由于仅用Bam HI酶单酶酶切，得到的DNA片段有两种。正如“重组DNA分子的模拟操作”中用剪刀分别切割目的基因所在DNA片段及质粒载体片段，可以得到红色的目的基因片段和绿色的质粒载体片段。用红色胶布或订书钉进行连接之后，黏性末端相同的都可以连接在一起。根据模拟操作可知，能够形成三种连接产物：目的基因—目的基因、目的基因—质粒载体、质粒—质粒三种连接产物。将这三种连接产物一起转化大肠杆菌，由于转化了目的基因—目的基因的连接片段的大肠杆菌、未转化的大肠杆菌不含有青霉素抗性基因所以不能区分。

笔者就“重组DNA分子的模拟操作”进行了对比教学，一个班级先进行模拟操作，而后做练习题，另一个班级反之，结果发现先进行模拟操作的学生的两道练习题的正确率明显高于另一个班级。可见，模拟操作有助于具体化抽象概念，促进学生在动手、动脑过程中建构、理解与应用生物学概念，提高理性思维能力。

［1］温青.对培养学生生物学科核心素养的认识［J］.福建基础教育研究，2016（2）.

［2］俞红成.高中生物学科核心素养的教学培养策略［J］.中学生物教学，2016（4）.

（责任编辑：陈欣）