硬脂酰氯改性对莲原花青素低聚体在油脂体系中抗氧化性质的影响

张亚楠,谢笔钧,孙智达

(华中农业大学食品科技学院,湖北武汉 430070)

硬脂酰氯改性对莲原花青素低聚体在油脂体系中抗氧化性质的影响

张亚楠,谢笔钧,孙智达*

(华中农业大学食品科技学院,湖北武汉 430070)

莲原花青素低聚体具有良好的抗氧化活性,因其富含酚羟基亲水性较高而限制了在油脂体系中的添加应用。为提高莲原花青素低聚体的抗油脂氧化性能,本研究利用硬脂酰氯对其改性,重点研究了反应物配比、催化剂用量和反应温度对反应的影响以及工艺条件的优化,同时探讨了其抗油脂氧化特性并对其分子结构初步表征。结果表明,改性最佳工艺条件为莲原花青素低聚体、硬脂酰氯、催化剂质量比为1∶2∶1.5(w∶w∶w),反应温度40 ℃,添加改性物的菜籽油经100 ℃高温氧化24 h后的POV为6.04 meq/kg,比添加未改性莲原花青素低聚体的对照组降低了31.6%。改性物红外图谱显示有亚甲基、脂肪长链和酯基基团特征吸收峰,可以说明莲原花青素低聚体与硬脂酰氯发生酯化交联,脂溶性得到改善从而使其在油脂中的抗氧化性能得到提高。

莲原花青素低聚体,硬脂酰氯,改性,脂溶性,抗氧化性

油脂是食品中重要成分之一,油脂氧化不仅严重影响食品品质,氧化过程中还会产生过氧化物、自由基、醛、酮等危害身体健康的物质[1]。在油脂中添加抗氧化剂是延缓油脂氧化的一种最为有效的方法,近年来应用广泛的合成抗氧化剂因其毒性与致癌危险在一些国家和地区使用受到限制,因此天然抗氧化剂以其无毒高效的优势日益获得人们的青睐。

表1 莲原花青素低聚体改性物制备的单因素实验

2014年6月,国家卫计委发布了增补茶多酚棕榈酸酯等两种食品添加剂的公告,现已被收录进GB 2760-2014,目前最常用的化学修饰法合成茶多酚脂肪酸酯或儿茶素衍生物等的研究相对成熟。本实验从茶多酚类物质的化学改性提高脂溶性的相关研究中得到启发试图通过对莲原花青素低聚体引入长碳链来修饰其分子结构以改变其亲水特性,实验利用硬脂酰氯对LSOPC进行酯化改性合成脂溶性改性物,通过单因素实验及正交实验优化反应条件,研究改性LSOPC在油脂体系的抗氧化性能和脂溶性,为原花青素在油脂领域的拓展应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莲原花青素粗提取物、菜籽油(未加添加剂) 中国农业科学院油料作物研究所提供;硬脂酰氯 上海艾科达化学试剂有限公司;碳酸氢钠、乙酸乙酯、无水乙醇、冰醋酸、氯仿等 均为分析纯。

RE-3000旋蒸仪 上海亚荣生化仪器厂;UV-2100紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 武汉科尔仪器设备有限公司;SHZ-82A恒温振荡器 常州国华电器有限公司;SB-5200DT型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;WH-1微型旋涡混合仪 海沪西分析仪器厂有限公司;Avanti J-E超速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 莲原花青素低聚体制备 取适量莲原花青素粗提取物,用蒸馏水溶解,质量比1∶30(样品∶水)。并用超声波清洗仪以功率250 W,40 kHz处理20 min使之溶解完全,10000 r/min条件下离心15 min,取红棕色上清液,抽滤,使得抽滤后的液体中的固体尽量除去。抽滤得到的液体再用乙酸乙酯萃取,其体积比为1∶3(液体∶乙酸乙酯),充分摇匀,静置等至完全分层后,收集上层液,回收下层液,重复萃取。将取得的上层液置于旋转蒸馏瓶中,在40 ℃下旋干,加少量蒸馏水复溶,溶解的红棕色液体用塑料杯装适量,冷冻干燥得到的浅红棕色粉末即为原花青素低聚体[5]。

1.2.2 莲原花青素低聚体改性工艺流程 参照Ying Zhong合成EGCG酯[6]、邵卫梁等人对茶多酚棕榈酸酯的研究[7],确定LSOPC改性的工艺流程为:称取0.5 g莲原花青素低聚体,量取40.0 mL乙酸乙酯加入250 mL锥形瓶,加入目标量的碱性催化剂碳酸氢钠、硬脂酰氯(逐滴振荡加入),充氮气保护,在30～70 ℃温度范围的水浴中振荡反应7 h,反应后过滤得到乙酸乙酯深红棕色液体。用三倍体积的蒸馏水洗涤至溶液呈中性,再于40 ℃下真空旋蒸出乙酸乙酯,最后将得到的改性物干燥,研磨成粉末,置于自封袋中低温避光保存备用[8]。

1.2.3 莲原花青素低聚体改性单因素实验 按照表1进行莲原花青素低聚体改性单因素实验。固定催化剂用量0.5 g/0.5 g LSOPC、反应温度40 ℃,因实际参与反应为LSOPC中有效酚羟基,需考虑LSOPC过量情况且硬脂酰氯过多最终反应液呈粘稠态无法干制,故设置反应物配比为2∶1,1∶1,1∶2,1∶3,1∶4(即莲原花青素低聚体与硬脂酰氯质量比,将LSOPC用量固定为0.5 g);催化剂用量作单因素的实验条件为反应物配比1∶2、反应温度40 ℃;反应温度作单因素的实验条件为催化剂用量0.5 g/0.5 g LSOPC、反应物配比1∶2。

1.2.4 莲原花青素低聚体改性正交实验 为优化改性工艺,以反应物配比、催化剂用量、温度为变量进行3因素3水平的L9(33)正交实验,各自变量水平的选取根据单因素实验结果进行确定,具体见表2,其中固定莲原花青素低聚体用量为0.5 g。

表2 莲原花青素低聚体改性物制备的正交实验因素水平设计

1.2.5 油脂的抗氧化实验 为提高工作效率,进行如下油脂高温破坏实验:取等量菜籽油5 g于小烧杯中,加入质量分数为0.4%的改性莲原花青素低聚体样品,超声均匀,同时设置对照组。将上述油样置于100 ℃烘箱内24 h(脂肪酸在高温下极易氧化分解),24 h后立即测定指标[8]。

1.2.6 POV测定 按GB/T 5538-2005《动植物油脂过氧化值测定》中的方法[9]。

1.2.7 莲原花青素低聚体分子官能团的光谱测定 红外光谱:使用红外光谱仪,在400～4000 cm-1范围,取1～2 mg样品粉末,与KBr混合均匀并压片,扫描后得到特征谱带。

1.2.8 LSOPC改性物脂溶性总酚含量测定 邻酚羟基在三乙醇胺水溶液中与亚铁离子生成紫蓝色络合物,该紫蓝色络合物在540 nm处有最大吸收峰,UV测定吸收值,并与标准品没食子酸乙酯比较,得到脂溶性总酚含量[10]。

1.2.9 油水分配系数(LogP)的测定 准确量取50 mL正辛醇与150 mL超纯水于具塞锥形瓶中,摇床振荡24 h,使二者相互饱和,静止分层后于分液漏斗分离,保存备用,上层为水饱和的正辛醇,下层为正辛醇饱和的水。分别称取LSOPC、LSOPC改性物各5 mg,用水饱和的正辛醇溶解并定容至10 mL,配制成0.5 mg/mL的水饱和的正辛醇溶液,在280 nm下测其吸光值Ax。分别量取含LSOPC、LSOPC改性物0.5 mg/mL的水饱和的正辛醇溶液与正辛醇饱和水各5.0 mL,恒温振荡24 h后5000 r/min离心20 min,分离出油相,在280 nm下测其吸光值A0。通过公式Log P=LogAx/(A0-Ax)计算油水分配系数[9]。

1.2.10 LSOPC改性物清除DPPH自由基实验 将最优组改性物配制得到适宜浓度的样品乙醇溶液,并稀释得到不同浓度梯度的样品溶液分别取2 mL加入，再向各管中注入2 mL DPPH·溶液,混合均匀后黑暗中静置30 min,用1 mL比色皿测溶液在517 nm处的吸光度值,记作A1;以不加样品时的吸光度值为对照,记作A2;待测样品和DPPH·溶液溶剂(乙醇)的混合物的吸光度值为空白,记作A0平行操作三次,取平均值,公式为

计算样品对DPPH自由基的清除率,并绘制DPPH自由基清除率对样品添加浓度的曲线。根据曲线,计算得DPPH自由基原始质量浓度减少至50%时的脂溶性莲原花青素低聚体的添加量,用IC50表示,IC50值越小,清除自由基的能力越强[11]。

1.2.11 油脂长期抗氧化实验 将分别加入质量分数为0.02%的LSOPC改性物、LSOPC、茶多酚棕榈酸酯、VC、VE、BHT、TBHQ的菜籽油及空白油样置于60 ℃烘箱内,每4 d测定一次POV值[12]。

1.3 统计分析

采用SPSS 17.0统计软件进行分析,数据均以平均数±标准差(x±s)表示,用Origin 8.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 莲原花青素低聚体改性单因素实验结果

2.1.1 反应物配比对莲原花青素抗氧化性的影响 如图1所示,随着反应物配比的增加,添加莲原花青素低聚体改性物的菜籽油POV呈现先降低后升高的趋势,反应物配比为1∶1时POV最低为(6.45±0.103) meq/kg,随着反应物配比增大,改性物抗油脂氧化能力降低可能是因为硬脂酰氯过量导致改性产物不纯。申雷等认为,硬脂酰氯改性茶多酚过程中,茶多酚分子中只有活性较强位点的酚羟基才能参与酯化反应[5],所以推测本实验反应过程中已结合的硬脂酸长碳链会限制LSOPC与更多的硬脂酰氯反应。因此选择反应物配比为2∶1、1∶1、1∶2作为正交实验的因素水平。

图1 反应物配比对LSOPC抗氧化性的影响Fig.1 Effect of reactant proportion on antioxidation activity of LSOPC

2.1.2 催化剂用量对莲原花青素抗氧化性的影响 如图2所示,随着催化剂用量的增加,添加莲原花青素低聚体改性物的菜籽油POV呈现先降低后升高的趋势,催化剂用量为0.5 g/0.5 g LSOPC时POV最低为(6.53±0.112) meq/kg,因此选择反应物配比为0.25、0.5、0.75 g/0.5 g LSOPC作为正交实验的因素水平。

图2 催化剂用量对LSOPC抗氧化性的影响Fig.2 Effect of catalyst use level on antioxidation activity of LSOPC

2.1.3 反应温度对莲原花青素抗氧化性的影响 如图3所示,随着温度的升高,添加莲原花青素低聚体改性物的菜籽油POV呈现先降低后升高的趋势,反应温度为40 ℃时POV最低为(6.53±0.112) meq/kg。推测当温度较低时,反应速度慢,莲原花青素低聚体的改性不充分;随着温度升高,酯键更容易形成;但温度过高乙酸乙酯挥发加快,且莲原花青素低聚体氧化速度加快,产物抗氧化活性降低。因此选择反应物配比为30、40、50 ℃作为正交实验的因素。

图3 反应温度对LSOPC抗氧化性的影响Fig.1 Effect of reaction temperature on antioxidation activity of LSOPC

表3 莲原花青素低聚体改性优化实验结果

2.2 莲原花青素低聚体改性正交实验结果

改性正交实验结果见表3,0.5 g LSOPC其反应物配比、催化剂用量和反应温度分别为1∶2、0.75 g/0.5 g LSOPC和40 ℃(极差分析和表中最优均为A3B3C2)时,添加莲原花青素低聚体改性物的菜籽油POV取得最小值为(6.04±0.043) meq/kg。由表4可知,催化剂用量对莲原花青素低聚体改性物添加到菜籽油中的POV有显著性影响(p≤0.05);因LSOPC为低聚体的混合物,其空间位阻一定程度限制了酯化反应的进行,因此即使反应物配比不同实际参与的酚羟基数量有限,反应物配比对LSOPC改性物抗氧化效果没有显著影响。确定莲原花青素低聚体改性最优工艺条件为A3B3C2,按此条件进行验证,制备所得LSOPC改性物以0.4%的比例添加到菜籽油中经100 ℃高温处理24 h实际测得POV为6.11 meq/kg,具有较好的抗油脂氧化能力。

表4 莲原花青素低聚体改性优化实验结果的方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00。

2.3 改性莲原花青素低聚体的红外光谱分析

图4、图5分别为LSOPC和LSOPC改性物的红外光谱图,对比发现二者均有酚羟基(3100～3500 cm-1)和苯环(1430～1620 cm-1)吸收峰存在,表明改性过程只是对LSOPC分子结构进行了部分修饰,并没有完全改变其结构;改性后的LSOPC有明显的甲基和亚甲基(2910～2960、2830～2870 cm-1)吸收峰以及羰基(1650～1740 cm-1)、碳原子数大于4的直链脂肪基团(720 cm-1)特征吸收峰,所以可以初步定性分析LSOPC与硬脂酰氯发生酯化交联,其分子结构引入了硬脂酸长碳链,但改性物的酯化位点并不确定,需对LSOPC改性物分离纯化并进行进一步结构鉴定[13]。

图4 LSOPC红外光谱图Fig.4 IR spectrum of LSOPC

图5 LSOPC改性物红外光谱图Fig.5 IR spectrum of modified LSOPC

2.4 LSOPC改性物脂溶性总酚含量测定结果

紫外测定的并非脂溶性总酚含量,而是未被酯化的酚羟基含量,由此可间接反映LSOPC的酯化程度,即酯化程度越高,总酚含量相应降低。标准品没食子酸乙酯标准曲线:Y=0.5497X-0.0273,R2=0.9994。

式中:E-样品相当标准含量,mg/100mL;m-样品质量,mg;G-样品水分质量,%。测定结果如表5所示,LSOPC改性前后总酚含量分别为73.56%、55.07%,可知改性后LSOPC总酚含量较改性前降低了25.14%。因为紫外测定的并非脂溶性总酚含量，而是未被酯化的酚羟基含量，由此可间接反映LSOPC的酯化程度，即酯化程度越高，总酚含量相应降低，所以LSOPC改性物与茶多酚棕榈酸酯相比，其酯化程度较低，猜测可能是因为茶多酚中儿茶素类单体含量较高,而本实验原材料莲原花青素低聚体平均聚合度为3.2[14],含有大量二聚体、三聚体,其构型一定程度阻碍了酚羟基与硬脂酰氯发生完全酯化交联,导致改性物酯化程度不高,仍有较多未酯化的酚羟基存在。

表7 不同贮藏时间下各抗氧化剂对菜籽油过氧化值的影响(meq/kg)

注：同列不同小写字母代表差异显著(p<0.05)。

表5 不同抗氧化剂的总酚含量

2.5 LSOPC改性前后油水分配系数比较

LSOPC改性前后LogP分别为0.35、0.53,可知改性后其油水分配系数增加,即LSOPC极性降低,脂溶性增强,达到预期目的。但是,改性后的LSOPC与市售添加剂茶多酚棕榈酸酯相比,其脂溶性较低。

表6 不同抗氧化剂的油水分配系数

2.6 LSOPC改性后对DPPH自由基清除率的影响

测定结果如图6所示,LSOPC改性前后IC50分别为8.0、17.5 μg/mL,改性后LSOPC对DPPH自由基的清除能力大大降低。因抗氧化剂清除DPPH自由基能力与酚羟基含量密切相关,而硬脂酰氯对LSOPC改性的酯化反应发生在酚羟基上从而使酚羟基数量减少。但是LSOPC改性依旧保留了其较强的清除DPPH自由基能力,再次表明改性过程只对LSOPC进行了部分修饰,并没有大幅度改变莲原花青素低聚体整体结构。

图6 LSOPC改性前后对DPPH自由基的清除率Fig.6 Inhibition efficiency of LSOPC and modified LSOPC to DPPH·

2.7 不同抗氧化剂对菜籽油长期抗氧化效果比较

如表7所示,所有添加抗氧化剂的油样与空白油样相比,各处理组均有较强的抗油脂氧化能力,且各处理组油样POV随着贮藏时间延长呈上升趋势。其中在贮藏8 d时,改性LSOPC的油脂POV比普通LSOPC降低42.1%,且差异显著(p≤0.05),说明改性后的LSOPC抗氧化性能提高,减少不饱和脂肪酸脂质过氧化[15],有效延长油脂氧化诱导期[16],可能是因为酯化反应引入的硬脂酸长碳链使得LSOPC分子更容易分散在油脂体系中。贮藏后期,改性LSOPC的抗油脂氧化活性要大大优于BHT、VC、VE,但与新型抗氧化剂茶多酚棕榈酸酯、TBHQ相比,改性LSOPC对油脂长期抗氧化效果要略差一些。

3 结论

利用硬脂酰氯对莲原花青素低聚体进行分子修饰,通过单因素及正交实验得到莲原花青素低聚体改性的最佳条件为莲原花青素低聚体、硬脂酰氯、催化剂质量比为1∶2∶1.5,反应温度40 ℃,得到的改性物能有效降低油脂POV,具有良好的抗油脂氧化能力。改性物波谱分析表明莲原花青素低聚体仅部分与硬脂酰氯发生酯化交联,改性物中仍含有酚羟基,因此改性莲原花青素低聚体的分子结构及作用机理还需进一步研究。

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Influence of stearoyl chloride modification on antioxidation of lotus oligomeric proanthocyanidins in oils

ZHANG Ya-nan,XIE Bi-jun,SUN Zhi-da*

(College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

Lotus oligomeric proanthocyanidins(LSOPC)has good antioxidant activity,but its hydrophilicity based on numerous phenolic hydroxyls limits its application in oil system. In order to increase antioxidation of LSOPC in oils,LSOPC was modified by stearoyl chloride. The effects of reactants ratio,catalyst use level and reaction temperature on the reaction as well as optimization of reaction conditions were mainly studied,antioxidant activity in oils and preliminary molecular characterize of modified LSOPC were also investigated. The results showed that the optimal reaction conditions were 1∶2∶1.5 of the mass ratio of LSOPC,stearoyl chloride and catalyst,reacting at 40 ℃. Under optimal conditions the POV of overheated rapeseed oil was 6.04 meq/kg,which was 31.6% lower than that of control group(added with LSOPC). IR spectrum analysis of modified LSOPC showed that cross-linking and esterification was formed between LSOPC and stearoyl chloride from characteristic absorption peaks of methylene,long fat chain and ester groups. So the antioxidation of LSOPC in oils was increased significantly because of its improved lipid solubility.

lotus oligomeric proanthocyanidins;stearoyl chloride;modification;lipid solubility;antioxidant activities

2016-11-14

张亚楠(1992-)，女，硕士，研究方向：天然产物化学，E-mail：yanangreat@163.com。

*通讯作者:孙智达(1963-)，男，博士，教授，研究方向：天然产物化学，食品安全，E-mail：sunzhida@mail.hzau.edu.cn。

TS201.2

A

1002-0306(2017)09-0097-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.010