固相萃取–高效液相色谱法同时测定饲料中4种磺胺类药物残留

陈卿卿，金迁，林灵超

(浙江福立分析仪器有限公司，浙江温岭 317500)

固相萃取–高效液相色谱法同时测定饲料中4种磺胺类药物残留

陈卿卿，金迁，林灵超

(浙江福立分析仪器有限公司，浙江温岭 317500)

建立固相萃取–高效液相色谱法同时测定饲料中的磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉4种磺胺类药物残留的方法。样品用乙腈提取，然后用碱性氧化铝固相萃取柱净化，色谱柱为C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以水–乙腈(体积比为75∶25，含0.3%乙酸)为流动相，流量为1.0 mL／min，检测波长为270 nm。4种磺胺类药物的质量浓度在1～10 μg／mL范围内与其色谱峰面积呈良好的线性，相关系数均大于0.999，检出限为0.025～0.133 μg／g。磺胺类药物测定结果的相对标准偏差为0.22%～0.30%(n=6)，样品加标回收率为93.6%～106.7%。实际饲料样品中均未检出这4种磺胺组分。该方法具有干扰少，灵敏度高，重复性好的优点，可以作为饲料中的磺胺类药物残留的一种检测方法。

磺胺类药物残留；固相萃取；高效液相色谱；饲料

磺胺类药物为人工合成的抗菌药物，可用于预防和治疗细菌感染性疾病，具有抗菌谱较广、性质稳定和使用简便等特点［1］。磺胺类药物常被个别饲料生产企业私自加到商品饲料中，导致养殖环节长期被动使用，在畜产品体内积累后，间接在人体内积蓄，最终产生耐药性，并影响人体中枢神经系统，引起泌尿道损害、造血功能障碍、过敏性反应等，临床上表现为晶尿、血尿、蛋白尿、溶血性贫血、再生障碍性贫血、皮疹、药疹以及胃肠道反应等，并有致畸、致癌、致突变的可能性［2］。因此国际食品法典委员会、我国及欧美一些国家明确规定食品中磺胺类药物总量不超过0.1 mg／kg，并且对于某些单一磺胺类药物的残留限量要求更低［3］。

目前，磺胺类药物残留的检测方法主要有微生物学法、免疫法和理化分析方法等。微生物学法简便、费用低，但操作费时而且敏感性、特异性较差，难以进行定性定量分析，不能满足现代残留检测的需要，甚至有些检测结果达不到最高残留限量的要求［4］；免疫法［5–7］使用了检测试剂盒检测，具有简便、快速，特异性强，灵敏度高，样品预处理简单等优点，符合快速检测的要求，但由于磺胺类药物是小分子物质，没有免疫原性，必须连接到大分子载体上产生特异性免疫应答，所以药物残留试剂盒在稳定性和准确度方面存在一定的局限性，检测过程中容易出现假阳性，造成干扰［8］；理化分析方法包括表面等离子谐振传感器法［9］、液质联用分析法［10–11］、毛细管电泳–电化学检测法［12］、高效液相色谱法［13–16］等。笔者通过对饲料基质的优化处理和色谱分析条件的优化选择，建立了用固相萃取高效液相色谱法测定饲料中4种磺胺类药物残留的方法。该方法具有干扰少、灵敏度高、检出限低、重复性好的优点。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC5090型，含紫外检测器、自动进样器，浙江福立分析仪器有限公司；

固相萃取真空装置：VM24型，博纳艾杰尔科技有限公司；

碱性氧化铝萃取柱：Cleanert Alumina-B型，1 000 mg／12 mL，月旭材料(上海)有限公司；

电子分析天平：FA1104型，感量为0.1 mg，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

振荡器：HY–2A型，江苏省金坛市友联仪器研究所；

氮吹仪：HGC–12A型，天津市恒奥科技发展有限公司；

磺胺嘧啶(批号：201200)、磺胺二甲嘧啶(批号：201209)、磺胺甲恶唑(批号：201209)、磺胺喹恶啉(批号：201209)标准溶液：质量浓度均为100 μg／mL，农业部环境保护科研检测所；

乙腈：色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司；

乙酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

实验用水为超纯水(自制)。

1.2 色谱条件

色 谱 柱：SapphiresilTM–C18柱 (250 mm×4.6 mm，5μm，浙江福立分析仪器有限公司)；流动相：水–乙腈(体积比为75∶25，含0.3%乙酸)；流量：1.0 mL／min；柱温：30℃；检测器：紫外检测器；检测波长：270 nm；进样体积：20 μL。

1.3 样品处理

1.3.1 提取

称取饲料样品约2 g，置于100 mL平底烧瓶中，加入25 mL乙腈，于振荡器中震荡提取30 min，转移上清液。残渣用25 mL乙腈重复提取1次，合并2次上清液，待净化。

1.3.2 净化

将碱性氧化铝萃取柱置于固相萃取真空装置上，以10 mL乙腈预淋洗，弃去淋洗液。取提取后上清液2 mL，移入碱性氧化铝萃取柱中，令其自然流出。收集全部流出液，用氮吹仪吹至近干，用流动相溶解并定容至1.0 mL，过0.45 μm滤膜，待上机测试。

1.4 标准溶液配制

混合标准溶液：精密移取磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉标准溶液适量，加乙腈配制成磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹啉质量浓度均为20 μg／mL的混合标准溶液，滤过，待用。

混合标准工作溶液：分别准确吸取适量混合标准溶液，用流动相稀释成0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg／mL 6个系列浓度，临用时配制。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

为达到较好的分离效果，对同规格(250 mm×4.6 mm，5 μm)的SapphiresilTM–C18色谱柱、Ultiamte XB–C18色谱柱、Inertsil ODS–3等系列色谱柱进行试验考察。结果显示，当使用SapphiresilTM–C18色谱柱时，色谱图基线平稳，分离度高，峰形良好，分析时间短。因此选择SapphiresilTM–C18色谱柱。

2.2 流动相的选择

分别选用水–乙腈（水相中含0.3%乙酸）、水–甲醇、水–乙腈进行了对比试验。试验结果表明，采用水–乙腈（体积比为75∶25，含0.3%乙酸）为流动相时，磺胺类各组分峰形、分离度较好，因此选用水–乙腈（体积比为75∶25，含0.3%乙酸）作为流动相。用水–乙腈(体积比为75∶25，含0.3%乙酸)为流动相时，磺胺类药物标准溶液、实际样品加标色谱图分别见图1、图2。

图1 磺胺混合标准溶液的色谱图

图2 空白样品加标的色谱图

2.3 检测波长的选择

由于磺胺类药物均含有对氨基苯磺酰胺结构，在波长250～285 nm内有强紫外吸收。试验显示，除磺胺喹唑啉的最大吸收波长在247 nm处，磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑三者的最大吸收波长均在267 nm附近。为了兼顾这几种磺胺类药物都要有较高的检测灵敏度，又要尽量避开干扰，试验选择在270 nm波长下测定。

2.4 固相萃取净化条件的选择

由于磺胺具有可离子化和极性强的性质，试验对比了硅胶柱、Cleanert Alumina-B柱、Oasis HLB等固相萃取柱。试验显示，磺胺类药物经乙腈提取过硅胶柱后回收率较低；Oasis HLB净化体系回收率在40%～80%之间，而且不稳定；而Cleanert Alumina-B柱净化效果和方法回收率均较好。因此实验选择Cleanert Alumina-B柱进行净化。

2.5 方法的线性和检出限

取1.4配制的系列混合标准工作溶液，按照1.2仪器条件进行测定，每个浓度进样3次。以各自峰面积(y)对质量浓度(x，μg／mL)进行线性回归分析，得到各磺胺类药物的线性方程和相关系数；以信噪比S／N=3确定各组分的检出限，结果见表1。

表1 标准曲线、线性范围、相关系数、检出限

由表1可知，4种磺胺类药物的质量浓度在0.1～10 μg／mL范围内线性良好，线性相关系数r2均大于0.999。

2.6 精密度试验

取2 μg／mL磺胺混标溶液，在1.2色谱条件下平行测定5次，记录每次测定的峰面积，计算其相对标准偏差，结果见表2。由表2可知，该方法具有良好的精密度。

表2 精密度试验结果

2.7 实际样品测定及加标回收试验

对某维生素预混饲料样品按照1.3进行样品处理，在1.2色谱色谱条件下进样分析，结果均未检出这4种磺胺类药物残留。然后在此饲料样品中分别加入一定量的混合标准工作溶液，使样品中4种磺胺类药物的含量分别为1，5，10 mg／kg，进行加标回收试验，结果见表3。

表3 实际样品测定及加标回收试验结果

由表3可知，样品加标回收率在93.6%～106.7%之间，说明该方法具有较高的准确度。

3 结语

采用固相萃取净化处理饲料样品，建立了高效液相色谱法测定饲料中磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉4种磺胺类药物残留的方法。该方法操作简单，测定结果准确可靠，可满足饲料中多种磺胺类药物残留日常检测工作需求。

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上海硅酸盐所研制出新型快检试纸有望用于尿糖快速检测

近年来，快速分析检测技术在化学检测、医学诊断、司法鉴定、环境监测和食品检测等领域具有广泛的应用。这一仪器分析检测工作过去往往需要求助于某些特定单位(机构)，如科研单位、医院、分析测试中心等。仪器分析方法具有高测定精度和低检出限, 但由于所用仪器一般是大型精密仪器, 且采用交流电做电源，操作较为复杂，使用不方便，一般不适合用于现场快速检测。随着科学技术的进步，各种现场性、临时性、快速高效的分析检测手段相继出现，这些分析检测手段大多是通过颜色变化以及变化程度来实现的。试纸法作为一种快速的现场检测方法，其特点是操作简单、携带方便、价格便宜, 并具有一定的选择性、准确性和灵敏度，在医疗卫生、食品、水质、空气及其它检测方面具有广泛的应用。因此，具备诸多优点的检测试纸应运而生。例如，现今市场上销售的早孕试纸为女性判断是否怀孕提供了快速高效的检测手段。

尿糖检测对分析人体健康状态非常重要，定期尿检已经成为大众生活中不可缺少的一部分。现今，尿糖检测试纸已经商品化。在尿糖的检测中，通常需要用到葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶以及显色剂。商业化的尿糖试纸将上述三种物质负载在纸条上，通过显色反应和比色卡来检测尿糖含量。然而，葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶这类天然酶价格高，其制备、提纯和储存均耗时耗力，而且检测活性易受外界环境如pH值、温度等影响。

近年来，具有天然酶活性的人工模拟酶受到人们的广泛关注。通过化学方法合成的人工模拟酶成本低，催化活性较为稳定，有望取代部分天然酶应用于分析检测领域。最近，中国科学院上海硅酸盐研究所研究员朱英杰带领的科研团队发明了一种有望用于尿糖检测的快速检测试纸，该检测试纸本身具有类似过氧化物酶的活性，可用于葡萄糖、过氧化氢等物质的快速分析检测。更重要的是该检测试纸制备简单、成本较低、稳定性好，可实现多次重复回收利用。相关研究工作发表在国际期刊《欧洲化学》上，入选热点论文和封面论文，并且申请了一项发明专利。论文发表后不久，Chemistry Views以Chemical Test Paper from Core/Shell Nanofibers为题对该研究工作做了报道。

研究团队发明的方法很简单，在羟基磷灰石超长纳米线上原位生长具有类过氧化物酶活性的Fe基金属有机框架复合物，利用羟基磷灰石超长纳米线上的钙离子与金属有机框架复合物上的羧基之间的耦合作用，制备具有核壳结构的羟基磷灰石超长纳米线金属有机框架复合物纳米纤维，并将其用于制备快速检测试纸。重要的是，该方法制备的快速检测试纸可实现多次回收再利用，只需将使用后变色的检测试纸浸泡在酒精中仅仅30 min后，检测试纸就重新变回原来的颜色。

高柔韧性羟基磷灰石超长纳米线是新型无机耐火纸的重要制造原料，在此之前，该团队开展了羟基磷灰石超长纳米线的制备方法探索研究，成功地制备出高柔韧性羟基磷灰石超长纳米线。该研究工作是新型无机耐火纸的系列研究工作之一，是该团队在成功研发出新型高柔韧性羟基磷灰石超长纳米线耐火纸、新型高效抗菌羟基磷灰石超长纳米线耐火纸、以及新型羟基磷灰石超长纳米线防水耐火纸之后取得的又一个新的重要研究进展。

相关研究工作得到国家自然科学基金、上海市科委、中科院上海硅酸盐研究所创新重点项目等资助。

（中国分析计量网）

食药监总局印发食品快速检测方法评价技术规范

2015年新食品安全法出台，规定“采用快速检测方法对食品进行抽查检测，被抽查人对检测结果没有异议的，可以作为行政处罚的依据”，某种程度上给快检结论赋予了法律效力，由此催生食品快检行业及快速检测方法的高速发展。

2017年3月28日，为保证食品快速检测方法评价工作的科学性和规范性，食品药品监管总局组织制定了《食品快速检测方法评价技术规范》。这也意味着风头正劲的快检技术自此有了评价规范，变得有据可依。 （仪器信息网）

Simultaneous Determination of Four Suifonamide Residues in Feeds by High Performance Liquid Chromatography with Solid Phase Extraction

Chen Qingqing， Jin Qian， Lin Lingchao
(Zhejiang Fuli Analytical Instrumentation Co., Ltd.， Wenling 317500， China)

A method was developed for simultaneous determining sulfadiazine, sulfadimidine, sulphamethoxazole, sulfaquinoxaline in feeds by high performance liquid chromatography with solid phase extraction. The feed sample was extracted by acetonitrile and then purified with Cleanert Alumina–B Solid Phase Extraction column，and separated on C18colunm(250 mm×4.6 mm，5 μm) by using mobile phase of acetonitrile–water (volume ratio was 75∶25，with 0.3% acetic acid) at flow rate of 1.0 mL／min，then detected at 270 nm. The concentration of four suifonamide residues had good linear relationships with the chromatographic peak area in the range of 1–10 μg／mL，the correlation coefficients were more than 0.999, the detection limits were 0.025–0.133 μg／g. The relative standard deviation of determination results was 0.22%–0.30%(n=6). The average recoveries were in the range of 93.6%–106.7%. The four suifonamide residues were not determined in actual feed samples. This method has the advantages of less interference, high sensitivity，good repeatability，and it is suitable for the determination of four sulfonamides in feeds.

suifonamide residue; solid phase extraction; HPLC; feed

O657.7

A

1008–6145(2017)03–0084–04

联系人：陈卿卿；E-mail: 740863318@qq.com

2017–02–18

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.03.020