离子色谱安培法测定尿液中的胱氨酸

石磊，钟春明，林青峰，刘慧，潘广文，李仁勇

［1.烟台毓璜顶医院，山东烟台 264000； 2.龙岩市公安局刑侦支队，福建龙岩 364000；3.泉州市环境监测站，福建泉州 362001； 4.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海 201206］

离子色谱安培法测定尿液中的胱氨酸

石磊1，钟春明2，林青峰3，刘慧4，潘广文4，李仁勇4

［1.烟台毓璜顶医院，山东烟台 264000； 2.龙岩市公安局刑侦支队，福建龙岩 364000；3.泉州市环境监测站，福建泉州 362001； 4.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海 201206］

建立离子色谱安培法检测尿液中胱氨酸的分析方法。将尿液稀释处理后，过OnGuard ⅡRP前处理柱，去除尿液中的有机物，选用低容量阳离子交换柱IonPac CS17 进行分离，以甲烷磺酸梯度淋洗，柱后用300 mmol／L NaOH溶液衍生，离子色谱脉冲安培法检测，外标法定量。胱氨酸的质量浓度在0.1～5.0 mg／L范围内与其色谱峰面积呈良好的线性，线性相关系数r2=0.999 9，检出限为0.05 mg／L。测定结果的相对标准偏差为0.71%(n=6)，样品加标回收率为94%～108%。该方法具有操作简单，专属性强，灵敏度高等优点，可用于临床快速检测尿液中的胱氨酸。

胱氨酸；尿液；安培检测；离子色谱法

胱氨酸是一种含硫氨基酸，在蛋白质中有少量存在，可用于食品工业。胱氨酸是人和动物体中一种非常重要的氨基酸，它被广泛应用于食品工业、饲料以及药物研究和制造业［1–3］。最近有研究表明，L-胱氨酸在铁元素从肝脏到血液的传输过程中发挥着重要作用［4］，而且人体内胱氨酸含量对严重威胁患者生命的HIV病毒感染的治疗非常重要。Gout的课题组研究表明，Nb2淋巴瘤细胞恶性增长过程与胱氨酸摄取能力的变化相关［5］。Martins等研究确信胱氨酸能够促进人尿中草酸钙晶体的生长和聚集，导致泌尿系统结石症［6］。根据结石成分的不同，结石可分草酸钙结石、磷酸钙结石、尿酸(尿酸盐)结石、磷酸铵镁结石、胱氨酸结石及嘌呤结石六类。大多数结石可混合两种或两种以上的成分。通过检测尿液中各离子的组成，可以辅助判断结石种类及碎石效果，对临床诊断和治疗具有重要意义［7］。胱氨酸作为胱氨酸结石的标志物，已有分析方法为HPLC法［8–10］、间接原子吸收光谱法［11］、GC–MS法［12］、离子交换–脉冲安培检测(IPAD)法［13–15］等。HPLC法和GC–MS法均需要衍生；间接原子吸收光谱法需要繁琐的反应，用到的试剂较多；传统的离子交换–IPAD法用强碱性洗脱液，胱氨酸在碱性条件下会水解为半胱氨酸，半胱氨酸为人体内氨基酸，因此作为体内胱氨酸的分析不能采用该方法。笔者采用阳离子交换柱，以酸性流动相洗脱，IPAD法用于结石病患者尿液中胱氨酸的检测。该方法操作简单方便，检测灵敏度高，且可避免半胱氨酸的干扰。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

离子色谱仪：Dionex ICS 5000+型，配有高压泵、淋洗液自动发生器、检测器和自动进样器，美国赛默飞世尔科技有限公司；

去离子水系统：GenPure Pro UV–TOC型，美国赛默飞世尔科技有限公司；

盐酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

甲烷磺酸：99%，美国赛默飞世尔科技有限公司；

氢氧化钠溶液：50%，美国赛默飞世尔科技有限公司；

L-胱氨酸：不小于99.7%，美国西格玛–阿拉丁有限公司；

尼龙滤膜：Thermo Scientific Target2型，30 mm，

0.45 μm，美国赛默飞世尔科技有限公司；

净化柱：Dionex™OnGuardⅡRP型，美国赛默飞世尔科技有限公司；

一次性使用无菌注射器：1 mL，上海米沙瓦医科工业有限公司；

实验用水为去离子水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

分析柱：IonPac CS17 型(250 mm×2 mm，美国赛默飞世尔科技有限公司)；保护柱：IonPac CG17 型(50 mm×2 mm，美国赛默飞世尔科技有限公司)；淋洗液：甲烷磺酸溶液，流量为0.3 mL／min；梯度洗脱程序：0～6.0 min为0.3 mmol／L 甲烷磺酸溶液，6.1～20.0 min为30 mmol／L 甲烷磺酸溶液，20.1～30.0 min为0.3 mmol／L 甲烷磺酸溶液；柱温：30℃；进样体积：10 μL；Au电极(AAA)，Ag／AgCl参比电极，安培检测器，氨基酸电位波型见表1。

1.2.2 柱后衍生条件

柱后衍生液为300 mmol／L NaOH溶液，流量为0.3 mL／min。

1.3 溶液制备

1.3.1 标准溶液制备

准确称取一定量(精确到0.001 g)的L-胱氨酸，用去离子水配制成质量浓度为1.000 g／L的胱氨酸标准品储备液。取上述标准品储备液，用去离子水配制成胱氨酸质量浓度分别为0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 mg／L的系列标准工作溶液。

表1 氨基酸电位波型

1.3.2 样品溶液制备

取990 µL尿样于10 mL容量瓶中，加入10 µL盐酸，摇匀后加入去离子水定容至标线，摇匀，依次过OnGuard ⅡRP柱和0.45 μm尼龙滤膜，弃去初滤液5 mL，收集后续滤出液。将滤出液稀释至20倍体积后进样分析。

1.3.3 柱后衍生液制备

NaOH溶液：300 mmol／L，取15.6 mL 50%氢氧化钠溶液稀释至1 L。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的选择

由于尿液中含有的大量有机物在离子色谱柱上保留很强，不能用甲烷磺酸淋洗液洗脱。将同一浓度的胱氨酸标准溶液过OnGuard ⅡRP前处理柱前后分别进样，胱氨酸色谱峰面积相同，说明OnGuard ⅡRP前处理柱对胱氨酸没有保留。因此将样品过OnGuard ⅡRP前处理柱，可有效去除尿液中的有机物。

2.2 色谱条件的选择

胱氨酸极性较强，在一般的C18柱上没有保留，因此选择离子交换色谱柱。胱氨酸为两性化合物，作为阴离子可在氨基酸分析柱上有保留，但氨基酸分析的淋洗液为碱性NaOH溶液，而胱氨酸会在碱性条件下水解为半胱氨酸，半胱氨酸在人体内广泛存在，因此不能选用NaOH溶液作为淋洗液，以防止胱氨酸水解［16–17］。作为阳离子胱氨酸可在阳离子交换柱上保留，且可与常规阳离子很好的分离。考虑到尿液中成分复杂，含有大量代谢产物等有机化合物，这些化合物在阳离子色谱柱上也会有保留，因此选择柱容量低的CS17为分析柱。在将胱氨酸与其它化合物分开的同时将其它有保留的离子洗脱，不会影响样品分析的重现性。

2.3 干扰影响

在样品前处理时加入钠、钾、镁、钙等阳离子，这些离子在电化学检测器上没有响应。电化学检测是通过测量电化学活性物质在适当的施加电位下发生氧化或还原反应时所产生的电流变化从而测定该物质的一种检测技术。人体中含量较高的钠、钾、镁、钙不能发生氧化还原反应，所以对胱氨酸的检测没有干扰。因为人体内存在半胱氨酸，因此加入半胱氨酸标准溶液，确认半胱氨酸与胱氨酸可以基线分离，色谱图见图1。

图1L-胱氨酸标准溶液与半胱氨酸标准溶液色谱图

2.4 柱后衍生液的影响

因为金电极需要在碱性条件下工作，但是该实验色谱条件为酸性淋洗液，因此需要在柱后加入碱液，提供碱性检测环境。为使胱氨酸在金电极上有更高的响应值，对不同浓度、不同流速的柱后衍生液进行试验。试验考察了100，200，300，500 mmol／L NaOH溶液，并分别在每个浓度的NaOH溶液下考察了0.1，0.2，0.3，0.5 mL／min 4种不同流量的影响。试验发现500 mmol／L NaOH溶液在0.3 mL／min流量下，噪音最小，胱氨酸的信噪比最高，因此选用此条件作为柱后衍生条件。

2.5 线性方程、线性范围和检出限

在1.2色谱条件下，测定1.3.1配制的胱氨酸系列标准工作溶液，以胱氨酸的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程为Y=6.033 3X+0.073 2，相关系数r2=0.999 9，线性范围为0.1～5.0 mg／L。以信噪比(S／N)为3计算胱氨酸的检出限，计算得胱氨酸的检出限为0.05 mg／L。结果表明，该方法线性范围宽、相关性好，且检出限低，可满足临床检测尿液样品中胱氨酸的要求。

2.6 精密度试验

对同一尿液样品中的胱氨酸含量进行6次平行测定，结果见表2。由表2可知，胱氨酸测定结果的相对标准偏差为0.71%，保留时间的相对标准偏差为0.06%，说明该方法具有较高的精密度，满足分析要求。

表2 精密度试验结果

2.7 实际样品分析及加标回收试验

按1.3.2对尿液样品进行处理后在1.2仪器工作条件下进样测定，并对样品进行加标回收试验。样品测定结果列于表3，回收试验结果见表4，样品溶液加标色谱图见图2。由表4可知，3个加标水平的回收率在94%～108%之间，说明该方法具有较高的准确度，可用于临床检测该类型样品。因为尿液中胱氨酸的检测结果为阳性，可初步判断该患者有肾结石。

表3 样品测定结果

表4 加标回收试验结果

图2 尿液样品加标色谱图

3 结语

以低容量IonPac CS17为色谱柱，甲烷磺酸为流动相梯度洗脱，建立了离子色谱安培法直接检测尿液中胱氨酸的方法。该方法样品前处理简单，分析时间短，灵敏度高，专属性强，回收率良好，可用于临床快速检测尿液中的胱氨酸。

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《宇航计测技术》简介

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《宇航计测技术》2017年第2期目录

高光谱红外成像系统的乒乓缓存设计

空间光纤传感测量技术应用研究

一种基于面源黑体的某型红外动态模拟靶标研制

基于LabVIEW的陀螺平台测试系统设计与实现

平衡功能测试与评估系统数据预处理方法研究

发动机气瓶热防护产品绝热性能评定研究

基于ARVM模型的液体火箭发动机试验台故障预测方法

基于Labview的振动冲击测量系统设计

转轴扭转变形动态测量噪声消除方法研究

JJG 860–2015 《压力传感器（静态）检定规程》浅析

空间碎片材料检测技术研究

某飞行器铁路运输环境测试系统研究

深空遥操作大回路延时研究

利用静电双探针对辉光放电等离子体诊断分析

指标测试在导航雷达检修维护中的应用

一种交直流差可计算电阻的设计

北斗D2导航电文解析和完好性性能分析

浅析仪器仪表机箱三防设计技术

一种手持式校准控制器设计与实现

基于感应传感的位置增量编码器设计

Determination of Cystine in Urine by Ion Chromatography with Pulsed Amperometric Detection

Shi Lei1， Zhong Chunming2， Lin Qingfeng3， Liu Hui4， Pan Guangwen4， Li Renyong4
(1. Yantai Yuhuangding Hospital， Yantai 264000， China; 2. The Criminal Investigation Branch of Longyan Municipal Public Security Bureau, Longyan 364000, China; 3. Quanzhou Environmental Monitoring Station， Quanzhou 362001， China; 4. ThermoFisher Scenitific， Shanghai 201206， China)

The method for the determination of cystine in urine was developed by ion chromatography with pulsed amperometric detection. The urine sample was diluted，then the organic matter in the urine was removed by a OnGuard ⅡRP pretreatment column，and the filter liquor was separated by using low capacity of cation exchange column IonPac CS17 with methane sulfonic acid as gradient elution，and derived by 300 mmol／L NaOH solution，the content of cystine in urine was determined with ion chromatography pulse ampere method and external standard method. The mass concentration of cystine in urine had good linear relationship with the chromatography peak area in the range of 0.1–5.0 mg／L with the correlation coefficients(r2) of 0.999 9. The detection limit of the method was 0.05 mg／L. The relative standard deviation of determination results was 0.71%(n=6). The recovery of sample was 94%–108%. The method is suitable for the determination of cystine in urine with a simple operation，high specificity and sensitivity.

cystine; urine; ampere detector; ion chromatography

O657.7

A

1008–6145(2017)03–0072–04

联系人：刘慧；E-mail: hui.liu@thermofisher.com

2017–03–14

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.03.017