液相色谱－质谱法测定丹溪玉屏风颗粒中黄芪甲苷含量

李光河

（广东省深圳市人民医院药学部，广东 深圳 518020）

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液相色谱－质谱法测定丹溪玉屏风颗粒中黄芪甲苷含量

李光河

（广东省深圳市人民医院药学部，广东 深圳 518020）

目的 建立测定丹溪玉屏风颗粒中黄芪甲苷含量的液相色谱－质谱法(LC－MS／MS)。方法 待测样品用0.1 mol／L NaOH甲醇溶液室温静置后超声提取，色谱柱采用Agilent SB－C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为甲醇－0.1%甲酸水溶液(70∶30)；质谱采用ESI源正离子－MRM模式下检测，选择离子对为807.2～627.4，流速为0.4mL／min。结果黄芪甲苷质量浓度在5.1～76.5 ng／mL范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率为99.42%，RSD＝3.34%（n＝6）。结论 该方法适用于测定丹溪玉屏风颗粒中黄芪甲苷的含量，同时可为丹溪玉屏风颗粒质量标准的建立提供依据。

丹溪玉屏风颗粒；益母草碱；液相色谱－质谱法；质量标准

丹溪玉屏风颗粒收载于部颁标准[1]，由黄芪、白术(炒)、防风组方，具有益气、固表、止汗的功效。方中黄芪善补气、固表、止汗，为方中君药。黄芪甲苷为黄芪的重要的活性成分，具有降压、消炎、抗衰老、抗病毒、增强免疫力等作用[2－4]，故测定黄芪甲苷对于丹溪玉屏风颗粒质量标准的建立具有重要意义。由于皂苷类成分在紫外区下有末端吸收，目前，多采用高效液相色谱－蒸发光散射（HPLC－ELSD）法测定丹溪玉屏风颗粒中黄芪甲苷的含量[5]。本研究中参考文献[6－7]，建立液相色谱－质谱（HPLC－MS／MS）法测定丹溪玉屏风颗粒中黄芪甲苷的含量，目的在于建立一个简单、快速的定量方法，为丹溪玉屏风颗粒质量标准的建立提高准确、可靠的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Agilent 6410三重四极杆质谱仪(美国安捷伦公司)；超声波仪(上海冠特超声仪器有限公司)；MS104S电子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 试药

丹溪玉屏风颗粒（云南白药股份集团有限公司，批号为 ZAB1637，ZDB1611，ZGB1615）；黄芪甲苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110781－201314，含量为95.8%）；甲醇(色谱纯，Sigma试剂公司)；氢氧化钠（分析纯，天津大茂化学试剂厂）；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

对照品溶液：称取黄芪甲苷对照品适量(以黄芪甲苷计10.2mg)，精密称定，置100m L容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成贮备液Ⅰ；从贮备液Ⅰ中吸取1.0 mL溶液，置100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成贮备液Ⅱ；从贮备液Ⅱ中吸取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5mL溶液，置100mL容量瓶中，用甲醇稀释制成系列对照品溶液Ⅰ－Ⅶ。

供试品溶液：取丹溪玉屏风颗粒，研细，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶，加入含0.1mol／LNaOH的甲醇50m L，室温静置2 h后，称重，超声30min后放置，冷却至室温，称重，以甲醇补足失重。于离心机中离心5min (转速为 4 000 r／min)，精密吸取上清液 1.0 m L置于100mL容量瓶，流动相定容，摇匀，微孔滤膜，即得。

阴性对照品溶液：按处方比例取缺黄芪的其余药味，制备缺黄芪的阴性样品，按供试品溶液制备方法得阴性对照品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent SB－C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：甲醇－0.1%甲酸水溶液(70∶30)；流速：0.4m L／min；柱温：30℃；进样量：20μL；分析时间：5.0 min。质谱采用 ESI源正离子－MRM模式。离子对：807.2～627.4；雾化器压力：35.0 psi；干燥气流速：8.0 L／min；干燥气温度：450℃；毛细管电压：4 000 V；四极杆温度：100℃。在拟订色谱条件下，阴性对照品溶液、对照品溶液、供试品溶液色谱图见图1。可见，阴性对照品溶液对样品测定无干扰。

2.3 方法学考察

线性关系考察：吸取系列对照品溶液各20μL，按拟订色谱条件进样，记录色谱峰面积。质量浓度(ρ)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，得黄芪甲苷回归方程 A＝2.07×102ρ＋2.47×102，r＝0.999 4。结果表明，黄芪甲苷质量浓度在5.1～76.5 ng／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：吸取系列对照品溶液Ⅴ，在拟订色谱条件下进样分析。结果黄芪甲苷样品峰面积分别为6 022.0，6 125.0，6 238.0，6 488.0，6 235.0，6 378.0，RSD为2.7%(n＝6)，表明仪器精密度较好。

重复性试验：取丹溪玉屏风颗粒2.0 g，精密称定，按2.1项下方法制备供试品溶液6份，在拟订色谱条件进行测定。结果黄芪甲苷含量分别为 70.81，71.76，70.24，71.42，68.85，68.41μg／g，RSD为2.0%(n＝6)，表明方法重复性较好。

稳定性试验：称取同一批丹溪玉屏风颗粒2.0 g，按供试品溶液制备方法制备溶液1份，置室温条件下，分别于0，2，4，6，8 h时进样分析。结果黄芪甲苷样品含量分别为 72.52，73.29，68.85，73.23，70.30μg／g，RSD为2.8%(n＝5)，表明供试品溶液在室温条件下放置8 h内基本稳定。

加样回收试验：取已知含量供试品约1.0 g，精密称定，分别加入贮备液Ⅰ0.7mL，依法制备成供试品溶液，进样分析，测定回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取丹溪玉屏风颗粒3批，每批3份，按2.2项制备供试品溶液，进样分析，计算上述样品的含量。结果见表2。

3 讨论

3.1 LC－M S／M S法选择

由于黄芪甲苷在紫外区下有末端吸收，会影响含量测定的准确性。药典中采用HPLC－ELSD法测定含量[5－8]，但缺点是灵敏度低、信号不稳定、重现性较差。参考文献[9－13]，选择灵敏度较高、信号稳定的LCMS／MS法测定黄芪甲苷的含量。在条件筛选中曾经比较正、负离子模式，结果发现，采用正离子模式较负离子模式黄芪甲苷的信号强，基线降低，故最终确定正离子模式测定。

表1 黄芪甲苷加样回收试验结果(n＝6)

表2 丹溪玉屏风颗粒中黄芪甲苷含量测定结果

3.2 流动相条件选择

由于质谱条件选择的是正离子模式，故流动相选择甲醇作为有机相，因为甲醇中的羟基能给出1个氢离子，有助于黄芪甲苷的解离；同时在流动相中加入一定量的有机酸也能促使黄芪甲苷的解离，尝试加入甲酸和乙酸，发现加入甲酸后黄芪甲苷色谱峰响应值高、柱效好，故选择加入0.1%的甲酸。考虑到黄芪甲苷的极性后经过调整，确定甲醇－0.1%甲酸水溶液(70∶30)，黄芪甲苷保留时间在3.5min，整个分析时间控制在5min内，可大大地缩短分析时间。

3.3 提取条件选择

自然界中黄芪甲苷单体在黄芪药材中的含量较低，黄芪药材中含量较高的成分为黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ等。黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ经过皂化反应脱去乙酰基才能转化为黄芪皂苷，参考文献[2，14－15]后，现在室温条件下用含0.1 mol／L NaOH的甲醇50 mL，室温静置2 h，充分发生皂化反应后，再用超声提取，皂化反应充分，提取率较高。同时，比较不同的碱化试剂，最后确定用0.1 mol／L NaOH皂化反应充分；比较超声提取、加热回流方法，最后发现超声提取法简便易操作，且提取率较高。故选用含0.1mol／LNaOH的甲醇50m L，室温静置2 h，充分发生皂化反应后，再用超声提取。

3.4 稳定性考察

仅考察了样品处理后在室温条件下放置8 h内的稳定性，原因为本试验中方法学考察时间大约为7 h，所以本试验中只考察了室温放置8 h的稳定性。样品是否能在更长时间内保持稳定，本试验中未进行继续考察。

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Content Determ ination of Astragaloside in Danxi Yuping Feng G ranu le by LC－M S／MS

Li Guanghe
(Department of Pharmacy,Shenzhen City People′s Hospital,Shenzhen,Guangdong,China 518020)

Objective To establish an HPLC－MS／MS method for content determination of astragaloside in Danxi Yuping Feng Granule.M ethods The sample was tested by ultrasonic extraction with 0.1 mol／L NaOH methanol solution at room temperature after stewing, The chromatographic separation was achieved on a Agilent SB－C18column(150 mm×4.6 mm,5μm)with a mobile phase of methyl alcohol－0.1% formic aicd in water(70∶30).The flow rate was 0.4 m L／min.Results The calibration curve was linear within the range of 5.1－76.5 ng／mL for astragaloside.The recovery was 99.42%,RSD＝3.34%(n＝6).Conclusion The method is suitable for content determination of astragaloside,it can be used for the quality control of Danxi Yuping Feng Granule.

Danxi Yuping Feng Granule;astragaloside;HPLC－MS／MS;quality standard

2016－12－07；

2017－01－22)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.07.007

李光河(1978－)，男，大学本科，主管药师，研究方向为医院药学，（电子信箱）jntj＿zgd＠163.com。

R284.1

A

1006－4931(2017)07－0021－03