7株桑黄遗传亲缘关系和栽培特性研究*

邵晨霞，靳 磊，唐少军，刘惠知，杨 祎，吴胜莲

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

〈生理生化〉

7株桑黄遗传亲缘关系和栽培特性研究*

邵晨霞，靳 磊，唐少军，刘惠知，杨 祎，吴胜莲**

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

对7株桑黄（Inonotus sanghuang）开展了菌丝特性、菌丝拮抗、酯酶同工酶和栽培试验。结果表明，桑黄SH3和SH7菌丝无拮抗现象，且两菌株间酯酶同工酶联合系数最大，遗传亲缘关系可能相同或非常近，其余菌株间遗传亲缘关系较远；人工栽培SH3、SH6和SH7可获得子实体。

桑黄；菌丝特性；亲缘关系；栽培特性

桑黄（Inonotus sanghuang） 是目前国际公认抗肿瘤效果好的大型药用真菌，按照现代分类系统该菌属于纤孔菌属（Inonotus）。自20纪以来，桑黄相关研究逐步成为热点，其中日本、韩国和中国研究最多，对桑黄的命名[1]、药理和产品开发进行了广泛研究[2－3]，对桑黄的认识进一步提高[4]。我国目前多个省份有野生桑黄发现，针对桑黄子实体成分、形态比较、分子鉴定研究和遗传结构分析不断深入[5－6]，桑黄形态学和分子系统学的研究取得了重要进展[7－8]，但目前湖南省未见有野生桑黄相关的报道。桑黄的分类和命名一直存在争议，对保藏的桑黄菌株开展遗传亲缘关系鉴定研究，是认识和开发桑黄的基础，对桑黄产业发展具有重要意义。本研究对从湖南张家界桑植地区采集的2株桑黄，与本中心原保藏的5株桑黄开展了菌丝特性、菌丝拮抗、酯酶同工酶和人工栽培特性进行研究，旨在研究各菌株间的遗传亲缘关系和桑黄的栽培特性，为进一步开展桑黄的分类鉴定和相关产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

桑黄菌株7株，依次编号SH1～SH7，保藏于湖南省微生物研究院菌种保藏中心。SH1购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号5.95；SH2购自华中农业大学菌种实验中心；SH4、SH5、SH6购自陕西科技大学；SH3、SH7由湖南张家界桑植地区采集的野生桑黄子实体分离获得。

1.2 平板培养基配方

综合马铃薯培养基：马铃薯（去皮）煮汁200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氢钾0.5 g、硫酸镁0.1 g、维生素B110 mg、琼脂18 g，加水至1 000 mL，pH自然。

1.3 酯酶同工酶染色液

称取25 mg乙酸-1-奈酯和25 mg乙酸-2-萘酯，用3 mL丙酮溶解。50 mg固蓝RR盐，再加入磷酸缓冲液（pH6.5）50 mL，过滤后与上述3 mL丙酮溶液混合，过滤后使用，现用现配。

1.4 原种和栽培培养基

培养基配方：木屑48%、棉籽壳30%、麸皮15%、玉米粉 5%、石膏 1.5%、MgSO40.2%、KH2PO40.3%，含水量60%。

1.5 方法

1.5.1 菌丝生长特性研究

桑黄接种至直径为9 cm的平板培养，培养温度28℃，4次重复，3 d后每4天测量1次菌丝直径（cm），计算平均值。第15天计算菌丝平均生长速度（cm·d-1）为菌丝直径除以培养天数，对各菌株菌丝平均生长速度进行差异显著性分析（显著水平P＜0.05）。

1.5.2 菌丝拮抗试验

将菌种接种到平板上，每个平板接种3个菌株，培养7 d～10 d观察菌种菌丝间是否有拮抗现象。

1.5.3 菌丝酯酶同工酶电泳试验

取培养皿培养的菌丝0.5 g，液氮研磨后加入1 mL磷酸缓冲液（pH 7.5），4℃，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，蔗糖溴酚蓝溶液（1∶1）与样品上清液2∶5混匀，即为电泳样品。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶5%，分离胶8%，垂直电泳槽电泳试验，点样量20 μL，4℃～10℃电泳，60 V电压电泳1 h，100 V电压电泳4 h结束电泳。电泳结束后放入酯酶同工酶染色液37℃染色20 min至酶带清晰，用清水漂洗数次，置乙酸溶液（70 mL·L-1）中固定，照相。酶谱分析得出各谱带相对迁移率（Rf），计算联合系数（S），即两菌株共有酶带数与两菌株酶带数之和减去共有酶带数的比值，公式为：式中：a表示A菌株酶带数；b表示B菌株酶带数；c表示A、B两菌株共有酶带数。

1.5.4 栽培试验

栽培和原种培养基装入直径15 mm的栽培袋，灭菌后接种。原种培养22 d左右，转接至栽培种培养基，26℃培养28 d左右，菌丝长满袋。置于温度20℃～25℃，湿度90%左右的出菇室进行出菇。

2 结果与分析

2.1 平板培养桑黄菌丝生长特性

7株桑黄菌丝平均生长速度和菌丝长势见表1。

表1 7株桑黄菌丝平均生长速度和菌丝长势Tab.1 Mycelium average growth rate and growth vigor of 7 Inonotus sanghuang strains

桑黄接种第3天至第9天菌丝生长速度快，之后逐渐减慢，15 d后菌丝生长非常慢。第15天测量菌丝直径（表1），SH3菌丝直径最大7.92 cm，菌丝平均生长速度为0.53 cm·d-1，其次为SH7和SH6，菌丝直径分别为7.46 cm和6.95 cm，平均生长速度为0.50 cm·d-1和0.46 cm·d-1，3个菌株菌丝平均生长速度不显著；SH1和SH4菌丝直径小，分别为3.75 cm和3.95 cm，平均生长速度为0.25 cm·d-1和0.26 cm·d-1，与SH3、SH7和SH6菌株相比菌丝平均生长速度差异达显著水平。菌丝长势方面SH1和SH4一般，其余几个菌株菌丝长势旺盛，培养过程中观察SH3和SH7菌丝生长最旺盛。

2.2 桑黄菌丝拮抗试验

7个桑黄菌株菌丝培养7 d～10 d观察拮抗情况，见图1。

SH3和SH7之间拮抗线不明显，其余各菌株菌丝间拮抗线明显。初步推断SH3和SH7可能为同一个种或遗传亲缘关系非常近，结果还需进一步开展分子鉴定、栽培试验等来进行验证。

2.3 桑黄酯酶同工酶试验

图1 7个桑菌株菌丝拮抗试验Fig.1 Mycelial antagonistic test of 7 Inonotus sanghuang strains

7个桑菌株菌丝酯酶同工酶电泳图谱和模式图见图2。

图2 7个桑菌株菌丝酯酶同工酶电泳图谱和模式图Fig.2 Mycelial esterase isozyme electrophoresis and pattern of 7 Inonotus sanghuang strains

桑黄SH1～SH7菌株共检出12条不同酶带，谱带数分别为4条、4条、6条、5条、4条、3条、5条，菌株间酶谱差异较明显，其中Rf=0.205酶带是7个菌株共有的。SH3和SH7酶谱差异最小，SH3比SH7在Rf为0.477处多1条酶带，其余5条带的位置相同，结合菌丝拮抗试验结果，推断SH3和SH7遗传亲缘关系较近。7个桑黄菌株酯酶同工酶相对迁移率（Rf）见表2。

表2 7个桑黄菌株酯酶同工酶相对迁移率Tab.2 Mycelial esterase isozyme mobility relative front of 7 Inonotus sanghuang strains

从7个桑黄菌株酯酶同工酶相对迁移率Rf值看出，7个菌株共有酶带Rf=0.205；除SH1外，其余6个菌株共有酶带Rf=0.295；SH1、SH3、SH4、SH7菌株共有酶带Rf=0.695；SH1、SH3、SH7菌株共有酶带Rf=0.727；同工酶谱带7个桑黄菌株间既有各种差异，又有一定数量的共有酶带，表明7个桑黄菌株的遗传多样性，同时其中某些菌株间可能遗传关系较近。7个桑黄菌株间联合系数（S）见表3。

联合系数可以更好地反映菌株间的遗传亲缘关系，值在0.1～1之间，越小说明两菌种间亲缘关系越远，反之则越近。7个桑黄菌株SH3和SH7联合系数最大（S=0.833），说明两菌株遗传亲缘关系相同或非常近。其余几个菌株的联合系数都未超过0.5，可认为它们之间的遗传亲缘关系较远。SH1和SH2，SH1和SH5菌株的联合系数都为0.143，推断他们的相似程度最低，遗传亲缘关系可能最远。

2.4 桑黄人工栽培特性

桑黄人工栽培出菇特性见图3。

图3 桑黄人工栽培特性Fig.3 Artificial cultivation characteristics of Inonotus sanghuang strains

采用常规的栽培方式，7株桑黄中SH3、SH6和SH7这三株出菇，其余几个菌株菌丝生长良好，但未长出子实体。3株桑黄的子实体成不规则的球盖形，表面有微细绒毛，初期颜色为浅黄色，后期逐渐加深呈浅褐色，采收的子实体横切面有同心环纹路。

3 讨论

通过对7个来源不同的桑黄菌株进行菌丝特性研究、拮抗试验、酯酶同工酶分析，表明湖南张家界桑植地区采集的野生桑黄SH3和SH7在综合马铃薯培养基生长较快；拮抗试验结果表明，SH3和SH7菌株之间拮抗现象不明显，酯酶同工酶联合系数最大，说明两菌株之间的遗传差异性较小，很可能是同一个种，酯酶同工酶结果与菌丝特性和拮抗试验结果基本一致。同工酶作为基因表达的产物，它能反映出个体间在DNA水平上的某些差异，是1种比较科学的种性鉴定方法[9]。目前国内桑黄人工栽培技术还不成熟，本研究中7株桑黄栽培有3株可长出子实体，其余菌株可能本身不能出菇，或菌株已退化，也可能采用其它栽培方式能出菇，这还有待于开展不同栽培试验进一步验证。

药用真菌作为中药宝库中的重要组成部分，日益受到人们的关注并已成为研究的热点。近年来桑黄鉴定主要依赖于子实体的形态特征，易受生长环境等因素影响，这造成了目前桑黄研究及应用中的混淆。分子生物学技术已被应用于真菌鉴定[10]，有较多关于利用ITS对大型真菌进行分子系统发育关系的研究报道，目前在食（药）用菌分类鉴定、种质资源评估、遗传多样性和亲缘关系分析上也有广泛应用[11-12]，应用rDNA ITS序列分析技术能够较准确区分桑黄真菌，有效鉴定桑黄[13]。因此下一步研究工作是广泛引进国内外已有桑黄菌株，采用分子生物学技术手段对桑黄菌株进行系统分类和鉴定，掌握桑黄资源的遗传特性基础信息，为更好地开发利用这一珍稀药用真菌奠定基础。

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Study on Genetic Relationships and Cultivate Characteristic of 7 Inonotus sanghuang Strains

SHAO Chen-xia,JIN Lei,TANG Shao-jun,LIU Hui-zhi,YANG Yi,WU Sheng-lian
(Hunan Province Microbiology Institute,Changsha 410009,China)

In this study,mycelial characteristics,antagonistic test,esterase isozyme and cultivation experiment of 7 Inonotus sanghuang strains were tested.Results showed that the mycelium of 7 I.sanghuang strains exsit obvious antagonism line to each other except SH3 to SH7,and esterase isozyme of SH3 and SH7 showed the largest similarity,which indicated that the genetic relationship of SH3 and SH7 may be the same or very close,and the rest strains were with great difference.SH3,SH6 and SH7 generated fruiting body by artificial cultivation.

Inonotus sanghuang strains;mycelium characteristics;genetic relationships;cultivation characteristic

S646.9

A

1003-8310（2017）03-0040-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2017.03.010

湖南省财政预算项目（2015[湘财预]0001号）。

邵晨霞（1980－），女，硕士，助理研究员，主要从事食用菌栽培和产品开发研究工作。E－mail:52073200＠qq.com

**通信作者：吴胜莲（1977－），女，本科，高级农艺师，主要从事食用菌菌种选育、栽培技术研究。E－mail:648289145＠qq.com

2017－03－15