脂联素影响肺动脉内皮依赖性舒张反应对肺动脉高压的作用*

金常娥 吴 迪 肖 露 傅应云 许 兰



脂联素影响肺动脉内皮依赖性舒张反应对肺动脉高压的作用*

金常娥 吴 迪 肖 露 傅应云 许 兰

目的：探讨脂联素(gAd)影响肺动脉内皮依赖性舒张反应，参与调控肺动脉高压(PAH)的作用。方法：选择36例肺动脉高压(PAH)患者(PAH患者组)和15例体检健康人群(健康对照组)，应用ELISA检测两组血浆gAd水平。分离存在PAH和无PAH肺病患者(PAH组和对照组，每组各5例)的三级肺小动脉制成血管环，采用器官浴槽技术先观察比较经去甲肾上腺素(PE)诱导收缩的两组血管环在不同浓度乙酰胆碱作用后的舒张反应；再观察PAH组血管环经gAd干预后在不同浓度乙酰胆碱作用后的舒张效应以及一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)对这种效应的影响。结果：PAH患者组血浆gAd水平显著低于健康对照组(P<0.01)。 与对照组肺血管环比较，PAH组PE收缩肺动脉环对乙酰胆碱诱导的舒张功能减弱(P<0.05) 。与PAH组肺动脉环比较，PAH+gAd组肺动脉环对不同浓度乙酰胆碱诱导的血管舒张功能增强(P<0.01)；而L-NAME对这种效应有降低作用(P<0.01)。结论：gAd可诱导肺动脉内皮细胞产生和分泌一氧化氮，促进肺动脉内皮依赖性舒张反应，从而减轻PAH。

脂联素；肺动脉高压；内皮依赖性舒张反应

肺动脉高压(Pulmonary Arterial Hypertension，PAH) 是肺动脉压力持续升高、伴或不伴有肺小动脉病变为特征的肺血管疾病，其发生率和病死率居高不下，已成为国人常见的肺部疾病[1]。肺动脉血管内皮功能紊乱所致肺血管阻力增加是PAH重要发病机制已成共识，如何有效保护血管内皮，防治PAH一直受到学术界广泛重视。脂联素(gAd) 是一种新型脂肪组织细胞因子，具有血管保护、调节代谢、影响组织重塑等作用。研究表明gAd水平降低可引起内皮功能障碍，两者关系密切[2]。动物实验提示，小鼠敲除gAd基因后喂食高脂饮食，可以引起血管内皮依赖性血管舒张功能受损[3]，因此，认为gAd可能促进血管内皮依赖性舒张反应。本研究探讨gAd是否通过促进肺动脉内皮依赖性舒张反应，达到调控PAH的目的。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014-12—2016-06深圳市人民医院门诊及住院的PAH患者36例(PAH患者组)，其中男15例，女21例，年龄20-70岁，平均58.0±8.0岁。入选标准：(1)患者具有正常民事行为能力，能理解和配合临床试验，并自行签署临床试验知情同意书；(2)20岁≤年龄≤70岁；(3)临床明确诊断为肿瘤相关性PAH、特发性PAH、慢性血栓栓塞性PAH患者。排除标准：(1)除上述三大病因之外的PAH患者；(2)无法配合完成临床试验、拒绝签署临床试验知情同意书的患者；(3)有精神疾病、药物成瘾史的患者；(4)合并重要器官功能障碍患者，包括严重心功能不全及心脏病、严重营养不良、严重肺纤维化、严重肝肾功能不全(谷丙转氨酶超过正常上限3倍、血肌酐和尿素氮大于正常值上限3倍以上)；严重凝血功能障碍；(5)未控制的高血压患者(>170/100mmHg)；(6)未控制的糖尿病患者；(7)合并妊娠以及哺乳者。依据彩色多普勒超声心动图诊断PAH的标准为肺动脉收缩压(PASP) ≥40mmHg[4]。选取同期体检健康人群15例为对照组(健康对照组)。本研究经过深圳市人民医院伦理委员会审核通过。两组人群年龄、性别构成、体质量指数(BMI) 、血脂异常、吸烟人数分布等差异均无统计学意义(P>0.05)，具有同质可比性。见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 血浆gAd测定

1.2.1 标本采集：采集PAH患者组治疗前和健康对照组人群空腹静脉血5ml，置于EDTA抗凝试管中，充分混合，静置15min以上，4℃ 2 500r/min离心15min，收集上清，-80℃保存待检。

1.2.2 测定方法：采用ELISA，具体操作参照试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号H179)提供的方法。

1.3 PASP测定

采用彩色多普勒超声心动图测定PASP。所有患者近2周未服用血管扩张剂,如前列环素类及其类似药物、内皮素受体拮抗剂、L-精氨酸或西地那非等。两组受检者休息30min后，由两位超声科医生按常规方法各测一次PASP，取均值进行统计分析。

1.4 gAd对人肺动脉血管环内皮依赖性舒张反应观察

1.4.1 人肺动脉血管环的制备和安置：肺动脉环来自深圳市人民医院胸外科肺部良性肿瘤手术患者。患者共10例，术前行彩超检查。其中5例存在PAH(PAH组)，另5例为非PAH(对照组)。排除术前高血压及长期服用降压药、心血管活性药物患者。肺叶切除后，迅速摘取病灶周围正常组织中三级肺动脉，置于自制盛Krebs缓冲液4℃培养皿中，完全去除血管周围多余结缔组织。选取直径3-4mm的小动脉环，快速移入浴槽内(预先装满Krebs缓冲液)，37℃恒温孵育5min后，一端固定，另一端连接张力换能器(TB611T，日本)和生理记录仪(RM6200,成都仪器设备厂)。实验中间隔10-15min更换一次缓冲液，浴槽内持续稳定通入高浓度O2(含CO25%)。

1.4.2 肺动脉血管环舒张反应：参考文献所述方法[5,6]，取对照组和PAH组肺动脉环各5支按上法置于浴槽中，向浴槽中加入1μmol/L去甲肾上腺素(PE，美国sigma公司)，恒温孵育使血管环收缩，收缩达峰值并稳定约20min后，再依次加入不同浓度的乙酰胆碱(1×10-8-1×10-4mol/L，美国Sigma公司)作用5min，记录每一浓度下肺动脉血管环舒张反应(%)。

1.4.3 gAd作用后肺动脉血管环的舒张反应：取PAH组患者的肺动脉环，分为三组，每组5支，即PAH组(Krebs缓冲液孵育)；PAH+gAd组(gAd 2 μg/ml 孵育)；PAH+gAd+L-NAME (一氧化氮合酶抑制剂)组(gAd 2 μg/ml+L-NAME 0.5mmol/L 孵育) 。孵育条件：37℃恒温水浴，孵育时间2h ，之后依次加入不同浓度的乙酰胆碱( 1×10-8-1×10-4mol/L) ，按照1.4.2方法进行血管环舒张功能测定。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 PAH患者血浆gAd水平降低

PAH患者组gAd水平明显低于健康对照组(7.79±2.19μg/ml vs 12.25±3.01μg/ml)，差异有统计学意义(t=5.91，P<0.01)。

2.2 PAH患者肺动脉环对乙酰胆碱诱导的舒张功能减弱

对照组和PAH组肺动脉环经PE诱导后，分别收缩90.56%和92.84%，加入不同浓度乙酰胆碱后，PAH组在各种浓度下的血管舒张幅度均明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 两组肺动脉对乙酰胆碱诱导的血管舒张幅反应±s，n均=5)

注：与对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 gAd使PAH患者肺动脉血管舒张功能增强

方差分析显示，经gAd等药物孵育后的三组血管环对乙酰胆碱诱导的舒张反应完全不同，差异有统计学意义(P<0.01)。两两比较，PAH+gAd组肺动脉环对不同浓度乙酰胆碱诱导的血管舒张幅度较PAH组均显著增强，而PAH+gAd+L-NAME组肺动脉对不同浓度乙酰胆碱诱导的血管舒张幅度较PAH+gAd组显著降低(P均<0.01)。见表3。

表3 gAd对乙酰胆碱诱导的肺动脉环血管舒张效应±s，n均=5)

注：与PAH组比较，1)P<0.01；与PAH+gAd组比较，2)P<0.01

3 讨 论

PAH的发生发展是一个复杂和多因素过程，各种原发性疾病导致血管阻力增加、继发血管周围无菌性炎细胞浸润、肺小动脉壁结构重构是其病理特征。PAH的确切发病机制迄今未能完全明确。肺小动脉壁结构重构后导致扩血管及缩血管调节激素的分泌失衡、激发异常的免疫反应、血管结构细胞生长及增殖过程失衡在其中发挥着重要作用；各种血管调控机制的分子介质和遗传因素异常都参与PAH的发生及发展[7，8]。而血管内皮细胞结构紊乱和调节功能异常在PAH病因中的重要作用成为相关研究的重点[9]。

肥胖及其并发疾病目前已经成为我国重要的公共卫生问题，因其罹患高血压、糖尿病、肥胖相关炎症综合征、冠状动脉粥样硬化性心脏病及中风的风险均明显高于非肥胖人群[10]。流行病学资料显示，BMI可影响PAH的发生发展及恶化[11]。但肥胖引发PAH的机制目前尚未明确。有研究认为脂肪组织是人体最大和最重要的内分泌器官，可以分泌多种活性调节介质(被称为脂肪因子)，其中最重要的脂肪因子就是gAd。既往研究发现gAd发挥着多种生物学功能，影响多种疾病,包括PAH的发生发展[12]。生理剂量gAd能参与或主导调节机体能量代谢、炎症反应过程和组织结构重构；低水平gAd会引起内皮细胞功能紊乱，参与高血压、动脉粥样硬化的发生[13]。有动物实验表明，高脂食物喂食的gAd基因敲除小鼠，其高血压的发生率明显升高，高血压调节机制受损，血管内皮功能明显不全；各种因素导致的gAd水平下降可使血管舒张功能受损，介导高血压、2型糖尿病和多种血管性疾病的发生及发展[14]。但是，gAd是否能够促进肺动脉内皮依赖性舒张反应，影响PAH的发生，至今未见报道。

本研究检测了PAH患者血浆gAd水平，结果表明PAH患者组与健康对照组在BMI及血脂异常等无统计学差异时，前者gAd水平明显低于后者(P<0.01)，其对乙酰胆碱诱导的肺动脉环舒张幅度也显著低于后者(P<0.01)，从而证实了gAd不仅参与体循环疾病如原发性高血压、中风等的发生，而且在肺循环疾病的发生发展过程中也起重要作用。继续观察发现，通过gAd恒温孵育后的肺动脉环被乙酰胆碱诱导的舒张幅度明显增加，提示gAd能够改善PAH患者肺动脉环内皮依赖性血管舒张功能。但当PAH+gAd组中加入L-NAME后，PAH+gAd+L-NAME组肺动脉环对乙酰胆碱诱导的舒张改善作用立即被拮抗，进一步提示gAd增强血管舒张功能是通过一氧化氮起作用的。这与既往研究所表明的gAd可以增加牛主动脉内皮组织中一氧化氮的分泌及释放的结果[15]有一致性。说明gAd的靶结构为肺动脉内皮，靶分子为一氧化氮。

综上所述，gAd通过诱导肺动脉内皮细胞一氧化氮的产生，从而促进肺动脉内皮依赖性舒张反应，最终减轻PAH；提高PAH患者血浆gAd水平、促进肺动脉舒张功能，可能成为PAH临床治疗的有效方法之一。

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本文第一作者简介：

金常娥(1981-)，女，汉族，博士，主治医师，主要从事肺部慢性疾病的研究

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The Effect of Adiponectin on Pulmonary Artery Hypertension by Regulating Endothelium-dependent Relaxation

JIN Chang-e, WU Di, XIAO lu, FU Yin-yun, XU Lan

Department of Respiratory and Critical Care Medicine, The Second Chinical Medical College of Jinan University, People's Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518020, China

Objective: To investigate the effect of adiponectin(gAd) on pulmonary artery hypertension (PAH) by regulating endothelium-dependent relaxation.Method: ELISA method was used to assess the level of gAd in plasma of 36 PAH patients (PAH group) and 15 healthy people(control group). After isolating the rings of pulmonary arteriole of patients suffering from lung disease with or without PAH(5 cases), the effects of different concentrations of acetylcholine (ACh) on the relaxation of two groups of vascular rings induced by norepinephrine (PE) were observed and compared by organ-bath technique. The effects of different concentrations of acetylcholine on the relaxation of vascular rings after gAd intervention in patients with PAH were also observed, and the effects of nitric oxide synthase inhibitor (L-NAME) were observed. Results: The plasma gAd in PAH group was significantly lower than that in the control group (P<0.01). Compared with control group, the diastolic function of PE-contracting pulmonary artery ring reduced induced by acetylcholine in PAH group (P<0.05). Compared with the PAH pulmonary artery ring, the pulmonary artery ring induced by different concentrations of acetylcholine was enhanced by PAH+gAd intervention (P<0.01) , and the effect of L-NAME was decreased (P<0.01) . Conclusion: gAd increases endothelium-dependent relaxation of pulmonary artery by inducing the production of nitric oxide, and finally decreases PAH.

Adiponectin; Pulmonary artery hypertension; Endothelium-dependent relaxation

广东省深圳市卫生计生系统科研项目(201501002)

暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院呼吸与危重症医学科, 深圳 518020

本文2017-01-20收到，2017-04-08修回

R563.3

A

1005-1740(2017)02-0013-04