超声波辅助提取香菇菌棒纤维素酶工艺优选研究

邓晓宇，陈华，徐倩倩，刘苗苗

超声波辅助提取香菇菌棒纤维素酶工艺优选研究

邓晓宇，*陈华，徐倩倩，刘苗苗

（鞍山师范学院化学与生命科学学院，辽宁鞍山114007）

以辽宁鞍山产的香菇菌棒为原料，采用超声波辅助提取纤维素酶，采用单因素试验和正交试验进行优化，确定最佳提取工艺条件为提取温度50℃，超声时间20min，超声波振幅90%，料液比1∶50，超声波法浸提液羧甲基纤维素酶酶活为7.25 IU/g，具有用时短、提取率高等优点。

超声波；纤维素酶；香菇；菌棒

0 引言

鞍山地区大量种植食用菌，其中香菇产量较高，每年会产生大量的菌棒。菌棒中含有丰富营养，但大部分菌棒被丢弃在户外，不仅造成食用菌生物资源的浪费，还引发害虫和病菌的滋生，危害自然环境和人类的健康[1-2]。根据报道，香菇菌棒富含有纤维素酶，提取其中的纤维素酶并加以利用，不仅为香菇菌棒资源的综合利用提供定量分析依据，同时对香菇废弃物资源再利用有重要意义。试验采用超声波辅助提取香菇菌棒纤维素酶，优化最佳提取工艺条件，为香菇菌棒中纤维素酶规模化工业生产及利用，提供一定的理论基础和技术依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

新鲜香菇（Lentinus edodes）菌棒（采收4茬后），由鞍山市宁远屯镇香菇种植农户提供。香菇品种为沈阳937#，栽培基质为木屑、麦麸、石膏、丰菇素。随机取30袋香菇菌棒，剥去菌袋，除掉菌渣表面的香菇，由拌料机处理30 min，使菌棒成分混合均匀。

1.2 试验仪器及试剂

UV-1800型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；KQ5200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；羧甲基纤维素钠（CMCNa），Sigma公司产品。

0.1 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH值5.5）、1mg/mL葡萄糖标准溶液、1%羧甲基纤维素钠溶液、3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 纤维素酶提取

待测酶液的制备：采收4茬后香菇菌棒，去除菌棒四周腐烂降解部分，剩余部分经自然风干、搅拌、粉碎后备用。取适量菌糠加10倍蒸馏水，置于匀浆机中充分打碎，于40℃水浴中保温45 min，经多层纱布过滤，滤液以转速4 000 r/min离心20 min，得上层清液即为粗酶液。

1.3.2 单因素试验

以羧甲基纤维素酶（CMC酶）酶活为测定指标，在提取温度50℃，料液比1∶50，超声时间25min，超声波振幅分别为60%，70%，80%，90%，100%的条件下测定酶活；在提取温度50℃，料液比1∶50，超声波振幅90%，超声时间分别为10，15，20，25，30，35 min的条件下测定酶活；在提取温度50℃，超声波振幅90%，超声时间25 min，料液比分别为1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60的条件下测定酶活；在料液比1∶50，超声时间25 min，超声波振幅90%，提取温度分别为40，45，50，55，60，65℃的条件下测定酶活。各条件均做3次平行试验，计算平均酶活。

1.3.3 正交试验设计

在单因素试验条件下，以羧甲基纤维素酶活为考查指标，对单因素中超声波振幅、提取温度、超声时间和料液比进行四因素三水平L9（34）的正交试验设计，测定羧甲基纤维素酶酶活，经统计分析得出最佳提取条件。

1.3.4 羧甲基纤维素酶酶活测定

（1）葡萄糖标准曲线的确定。分别取1mg/mL葡萄糖标准液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0mL于8支具塞试管中，用蒸馏水调至1 mL，然后向各试管中加入1.5mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至10 mL，充分混匀。于波长540 nm处测定OD值并记录结果，以葡萄糖质量浓度为横坐标、对应的吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

（2）羧甲基纤维素酶酶活测定。将酶液与底物分别于40℃水浴中预热，然后取0.5 mL酶液加入2.0 mL底物溶液中，混匀，置于40℃条件下反应30 min，加2.5mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴中5 min后，立即用自来水冷却。另做1个空白管，以0.5 mL水代替酶液，其他操作相同，在分光光度计上测出于波长540 nm处的吸光度，对照葡萄糖标准曲线，求出酶活。

（3）酶活单位的定义。羧甲基纤维素酶酶活（CMC酶酶活）指1 g香菇菌棒（干质量）在50℃，pH值5.5，1 min内水解纤维素生成1μmol葡萄糖酶的用量设为1个酶活单位，用IU/g表示。

式中：5.56——1mg葡萄糖的μmol数（1 000/180= 5.56）。

1.3.5 验证试验

采用正交试验设计得出最佳提取工艺条件后进行验证试验，测定羧甲基纤维素酶酶活。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的结果

已知葡萄糖质量浓度为0~0.1 mg/mL，于波长540 nm处测吸光度时，吸光度Y与葡萄糖质量浓度X之间呈现良好的线性关系，可利用标准曲线法对葡萄糖含量进行定量分析。以空白溶液作对照，绘制葡萄糖标准曲线，得线性回归直线方程Y=36.722X+ 0.005 64，相关系数R2=0.999 7。

葡萄糖的标准曲线见图1。

图1 葡萄糖的标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 超声波振幅对羧甲基纤维素酶活的影响

超声波振幅对羧甲基纤维素酶酶活的影响见图2。

图2 超声波振幅对羧甲基纤维素酶酶活的影响

超声波振幅在60%~100%时，随着超声波振幅增大，超声波破碎菌棒中菌丝细胞壁的作用加快，适于纤维素酶快速溶出。当超声波振幅为100%时，CMC酶酶活反而有些下降。在剧烈振荡过程中，可能部分破坏了纤维素酶结构，使提取量减少。

2.2.2 超声时间对羧甲基纤维素酶酶活的影响

超声时间对羧甲基纤维素酶酶活的影响见图3。

随着超声时间增长，菌丝细胞壁破碎程度加剧，溶出的酶量增多，羧甲基纤维素酶酶活增加。当超声时间超过20 min时，酶活下降，原因可能是超声时间增长，其他杂质也相继溶出，降低羧甲基纤维素酶酶活；也可能由于超声波剪切作用增强，导致酶分子结构遭到破坏。

2.2.3 提取温度对羧甲基纤维素酶酶活的影响

图3 超声时间对羧甲基纤维素酶酶活的影响

提取温度对羧甲基纤维素酶酶活的影响见图4。

图4 提取温度对羧甲基纤维素酶酶活的影响

随着提取温度升高，分子运动加剧，羧甲基纤维素酶溶出量增多，酶活增加。当提取温度超过50℃时，羧甲基纤维素酶酶活缓慢下降，可能是提取温度过高，导致其他杂质溶出较多，降低了羧甲基纤维素酶酶活。提取温度过高会影响酶结构的稳定性，降低酶的活性，对工业生产设备也会有更高的要求。

2.2.4 料液比对羧甲基纤维素酶酶活的影响

料液比对羧甲基纤维素酶酶活的影响见图5。

图5 料液比对羧甲基纤维素酶酶活的影响

料液比1∶50的提取效果最好。提取液越多，浓度差越大，扩散推动力越大，越有利于纤维素酶溶出，羧甲基纤维素酶酶活出现增加的趋势。当料液比1∶60时，提取液过量，消耗更多的时间和能量，阻碍超声波破碎细胞，其他的物质相继溶出，酶的浓度下降，导致酶活降低。

2.3 正交试验设计及结果分析

以羧甲基纤维素酶酶活为考核指标，对超声波振幅、超声时间、提取温度及料液比等单因素条件进行L9（34）正交试验设计，对试验结果进行极差和方差分析。结果表明，影响羧甲基纤维素酶酶活提取条件的主次因素为提取温度>超声波振幅>料液比>超声时间。从节约能源和时间等多方面因素综合考虑，超声波提取香菇菌棒纤维素酶的最佳条件为超声波振幅90%，超声时间20 min，料液比1∶50，提取温度50℃。

正交试验及结果分析见表1，方差分析见表2。

表1 正交试验及结果分析

表2 方差分析

2.4 验证试验

在最佳工艺条件下，测定纤维素酶活平均值为7.25 IU/g，优于其他试验条件下酶活。

3 结论与讨论

超声波辅助提取香菇菌棒中纤维素酶最适工艺条件为提取温度50℃，超声波振幅90%，料液比1∶50，超声时间20min。影响浸提的主次顺序为提取温度>超声波振幅>料液比>超声时间，测定纤维素酶活平均值为7.25 IU/g。超声波提取法具有提取率高、利于细胞破壁、用时短等优点，适于企业工厂化、规模化大量生产使用，试验也为香菇菌棒中的纤维素酶规模化生产及应用提供了一定的参考依据。

[1]刘莹莹，张坚，王红兵，等．菌棒酶提取与制备方法研究[J]．湖南农业科学，2010（1）：88－89，92．

[2]张国庆，董晓芳，王贺祥，等.8种食用菌菌渣中3种饲用酶活性的测定[J].中国食用菌，2009，28（5）：28-29.◇

Optimization of Ultrasonic-assisted Extracting Conditions of Cellulase from Lentinus Edodes Residue

DENG Xiaoyu，*CHEN Hua，XUQianqian，LIUMiaomiao
（School of Chemistry and Life Science，Anshan NormalUniversity，Anshan，Liaoning 114007，China）

Single factor and orthogonal experiments are employed to optimize the extracting conditions of crude cellulase from residue of Lentinus edodes by ultrasonic wavemethod.Results show that the optimal conditions are as follows：extracting temperatolre is 50℃，extracting time is 20min，ultrasonic wave amplitude is 90%，material-liquid ratio is 1∶50.In comparative experiments on extracting crude cellulase，CMC ase activity of extractapplied ultrasonic wavemethod are 7.25 IU/g.This method is superiorwith short time and high extraction.

ultrasonic wave；cellulase；Lentinus edodes；residue

TS209

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.012

1671-9646（2017）04a-0036-03

2017-04-01

鞍山市科学技术局项目（2013SY16）；鞍山师范学院教师科研立项课题（13KYXM32）；鞍山师范学院大学生创新创业训练计划资助项目（201410169037）。

邓晓宇（1993—），女，本科，研究方向为食品生物化学分析。

*通讯作者：陈华（1978—），女，硕士，讲师，研究方向为食品生物化学分析。